EHA105 農桿菌感受態細胞

產品信息：

組成 BC303-01
EHA105 Chemically Competent Cell 20×100μl
pCAMBIA2301（100ng/μl） 1 支
儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融。
基因型：
C58 (rif R ) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strep R ) Succinamopine
產品介紹：
EHA105 菌株由 EHA101 菌株改造而來，為 C58 型背景，核基因中含有篩選標簽——抗性基因 Rif，
為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型 Ti 質粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ，此質粒
含有 vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的
T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體 T-DNA 順利轉移）。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)
Ti 質粒含有篩選標簽：Strep，賦予 EHA105 菌株抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作經植物
雙元pCAMBIA2301 質粒檢測，轉化效率可達 10 3 cfu/μg，-70℃保存 12 個月轉化效率不發生改變。
轉化方法（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的 EHA105 農桿菌感受態細胞于冰水浴中融化；
2. 無菌條件下，向感受態細胞中加入 100ng-1μg 質粒 DNA（次使用前做預實驗確定所加質粒的
量），輕輕混勻，冰水浴中靜置 5 分鐘；
3. 將離心管置于液氮中速凍 5 分鐘；（注：也可以用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于 37℃水浴中保持 5 分鐘，不要晃動水面；
5. 將離心管放回冰水浴中，冰浴 5 分鐘；
6. 無菌條件下加入 800μl 無抗生素的 2xYT 或 LB 液體培養基，于 28℃振蕩培養 2-3 小時，菌體復蘇；
7. 6000rpm 離心 1 分鐘收菌，留 100μl 左右上清，輕輕吹打重懸菌體，取適量菌液，涂布于相應抗生素的
LB 平板上，于 28℃培養箱中倒置培養 48-72 小時。
（當平板只含有 50 μg/ml Kan 時，28℃培養 48 h 即可；平板中同時加入 50 μg/ml Kan，20 μg/ml Rif 時，需 28℃
培養 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif 則需要 28℃培養 72-90 h）。
注意事項
1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的 1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；
質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。
2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應
減少質粒用量。
4. 濃度不應高于 25 μg/ml，過高的濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。
5. 培養基中加入的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入 Ti 質粒篩選抗生素
可防止 Ti 質粒丟失，但 Ti 質粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮
這些抗生素，Ti 質粒丟失的概率極低(可以忽略)。


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