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　　染色凋亡試劑盒原理：

　　磷脂酰絲氨*（PS）在正常細胞中只存在于細胞膜內側，而在凋亡早期，PS由細胞膜內側外翻至細胞膜外側。Annexin V-PI染色凋亡試劑盒是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS特異性結合。AnnexinⅤ經過FITC、EGFP或PE標記后，作為熒光探針，即可通過PS特異性結合從而特異性標記凋亡早期細胞。

　　Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，但其不能通過活細胞的完整細胞膜，只能通過凋亡晚期和死細胞的細胞膜，因此只能用來標記凋亡晚期細胞和死細胞。

　　通過AnnexinⅤ與PI聯合標記，再經流式細胞儀或者熒光顯微鏡檢測，就可以確定細胞是活細胞、凋亡早期細胞還是凋亡晚期細胞或者死細胞。

　　試劑盒組成

　　A液（Annexin V-EGFP）、B液（PI溶液）、Binding Buffer

　　染色凋亡試劑盒實驗步驟：

　　1. 懸浮細胞處理：收集細胞懸液，900rpm 3min離心去除培養基后用PBS潤洗2次，再用Binding Buffer將細胞重懸為1x106個/ml的細胞懸液。

　　貼壁細胞處理：將細胞消化下來吹散后，離心去除胰m及培養基后用PBS潤洗2次，再用Binding Buffer將細胞重懸為1x106個/ml的細胞懸液。

　　2. 取100ul細胞懸液加入5ul A液與5ul B液，混勻后避光孵育10min。

　　3. 用熒光顯微鏡或者流式細胞儀檢測結果。

　　染色凋亡試劑盒注意事項：

　　1. 必須使用活細胞進行檢測，不能使用破壞細胞膜完整性的試劑處理細胞。

　　2. 普遍認為PI有潛在致癌風險，操作時注意戴手套操作，避免交叉污染。

　　3. 孵育結束后，應盡量在1h以內檢測結果，否則結果可能出現異常。

　　4. 細胞經過消化、離心、清洗后可能會出現凋亡增多的情況，因此必須注意操作盡量輕柔，離心轉速和時間盡量低，尤其是貼壁細胞不要消化時間過長導致細胞提前進入凋亡。

　　5. AnnexinⅤ是Ca2+依賴性的磷脂結合蛋白，因此消化細胞時盡量不要使用含EDTA的消化液，PBS也不要含EDTA等螯合劑。

　　6. 使用熒光顯微鏡檢測時，可以將貼壁細胞直接接種在玻片上，實驗時對細胞進行清洗染色后直接在玻片上觀察細胞，避免消化損失細胞導致凋亡率增加。

　　使用流式細胞儀檢測細胞時，可以根據實驗需要設置陰性對照（未染色）、單染對照（Annexin V-EGFP、PI分別單染）以調整熒光補償去除光譜重疊，同時根據未處理細胞空白對照和經Annexin V、PI分別細胞染色后的單染對照的分析設定十字門的位置。

熒光顯微鏡下檢測效果