弗氏檸檬酸桿菌PCR試劑盒

Citrobacter freundii PCR Kit

產品簡介：

熒光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測弗氏檸檬酸桿菌的試劑盒。

產品特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據弗氏檸檬酸桿菌高度保守的 VP1 區設計。

5. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

弗氏檸檬酸桿菌PCR試劑盒包裝規格及成分：

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：DNA 模板

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使用方法：

一.稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二.樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的標準曲線樣品的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。?

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做 2-3次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同 而自行優化）。

四、熒光定量 PCR 反應參數

五、數據處理
12.以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測 
13.如果有必要電泳確認，可取 10-20 uL PCR 產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產 物的大小為 400 bp。

熒光定量PCR結果分析:
一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化;在平臺期，擴增產物已不再呈指數級增加，PCR終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，無法計算起始模板拷貝數。因此只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了幾個重要的概念：擴增曲線、熒光閾值、CT值。