麥芽香肉桿菌熒光定量PCR試劑盒(染料法)

Carnobacterium maltaromaticum qPCR Kit(Dye Method)

產品簡介：

熒光定量 PCR 是檢測傳染性疾病的主流技術，本產品就是以染料法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測麥芽香肉桿菌的試劑盒。

產品特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據麥芽香肉桿菌高度保守的 VP1 區設計。

5. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳。

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麥芽香肉桿菌熒光定量PCR試劑盒(染料法)包裝規格及成分：

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：DNA 模板

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使用方法：

一.稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 段作為陽性對照。

1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二.樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的標準曲線樣品的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5 號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼容。?

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線樣品。如果做 2-3次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR（具體 PCR 參數可以根據儀器不同 而自行優化）。

四、熒光定量 PCR 反應參數

五、數據處理
12.以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

六、電泳檢測 
13.如果有必要電泳確認，可取 10-20 uL PCR 產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產 物的大小為 400 bp。

熒光定量PCR結果分析:
一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化;在平臺期，擴增產物已不再呈指數級增加，PCR終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，無法計算起始模板拷貝數。因此只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了幾個重要的概念：擴增曲線、熒光閾值、CT值。