免疫細(xì)胞化學(xué)ICC實驗服務(wù)

免疫細(xì)胞化學(xué)是將免疫學(xué)基本原理與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合所建立起來的新技術(shù),根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，檢測細(xì)胞內(nèi)某種多肽、蛋白質(zhì)及膜表面抗原和受體等大分子物質(zhì)的存在與分布。

一、 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的概述

免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry, ICC)一是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、屬離子同位素)顯色來確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分(主要是多肽和蛋白質(zhì)),

對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為~。

(一)免疫細(xì)胞化學(xué)對抗原和抗體的要求

1)具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實驗成功的首要條件。

對抗體的要求: 純度高、比活性強(qiáng);

2) 高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。

對抗原的要求:純度高，免疫原性強(qiáng)，穩(wěn)定無變化。

(二)免疫細(xì)胞化學(xué)抗原(antigen, Ag)

1)抗原的概念:凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液兔疫和(或)細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原。抗原具有兩個方面的

特性:

①免疫原性:引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細(xì)胞的特性;

②免疫反應(yīng)性:抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。

2)根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為:

①*抗原:分子量較大，-般在10kDa以上,并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。免疫原性z強(qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之;脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。

②半抗原:又稱為不*抗原，分子量較小。例如:某些短肽、多糖、類脂和藥物等。半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。

免疫細(xì)胞化學(xué)載體

通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。

①常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)、 牛血清白蛋白(bovine serumalbumin, BSA).卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)等。

②戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團(tuán)-NH2、-COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為5kDa結(jié)合5 ~ 25個分子的小肽。

(三)抗體(antibody, Ab)

1.抗體的概念:

①機(jī)體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱為抗體。

②抗體主要存在于血清內(nèi);

③抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不-定都是抗體。

④免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既lgG、lgD、 lgE、 lgA. IgM.

2、兔疫組化實驗中常用的抗體:單克隆抗體和多克隆抗體。

①單克隆抗體:是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備的。特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。

②多克隆抗體:是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。

-特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。

-多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機(jī)會。

-抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例， 當(dāng)抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。

3、抗體的制備一多克隆抗體的制備

①動物的選擇

②佐劑(adjuvant)

③免疫方法

④免疫劑量

⑤抗體效價的測定

⑥放血或定期抽血

選擇什么動物來免疫取決于:

(1)動物的選擇

①所需抗血清的量

小鼠只能提供1.0 ~ 1.5ml的血液，而山羊能提供幾升。

②能供免疫用的抗原量小鼠50mg足夠，而山羊需要幾毫克。

③動物的品系:免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。

例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。

常用的動物有兔、羊、馬、豬等,以兔(新西蘭兔，年輕，健壯,體重在2 .5kg左右,雄性)為z常用。

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