NobleRyderD9908  革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒 Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit

革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒 質(zhì)粒提取

產(chǎn)品貨號(hào)：D9908

產(chǎn)品名稱：革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒 Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit

英文名稱：Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：酶附件-20℃，其它試劑RT，復(fù)檢期1年

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyderD9908  革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒 Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit產(chǎn)品內(nèi)容

注意：使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

操作步驟（僅供參考）：  

1. 取1-5 mL 細(xì)菌培養(yǎng)物，12000 rpm離心1 min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。  

2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入200 μL溶液Ⅰ(請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器che底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。再向其中加入50μL溶jun酶，混勻，37℃水浴30 min以上（根據(jù)菌液量可適當(dāng)加長(zhǎng)水浴時(shí)間）。注意：如果菌塊未che底混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。如不能確定為何種菌，請(qǐng)按陽(yáng)性菌處理。  

3. 向離心管中加入250 μL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免污染基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。  

4. 向離心管中加入350 μL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000 rpm離心10 min 。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 取上一步上清，加入0.4倍體積無(wú)水乙醇，充分混勻。（體積過(guò)多可分兩次混合，然后上柱）。

6. 將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2 min，12000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完，可分兩次吸附) 。  

7. 向吸附柱中加入600μL漂洗液Ⅰ(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8. 向吸附柱中加入 700μL 漂洗液Ⅱ(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm 離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

9. 向吸附柱中加入500μL漂洗液Ⅱ，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

10. 12000rpm 離心 2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。

11. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

12. (可選)為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 2min，12000rpm 離心1min。

注意事項(xiàng)：  

1. 使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。  

2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μL，體積過(guò)小影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右( 可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍) ，pH 值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。  

3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10 kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10 mL過(guò)夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。  

4. DNA 濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。得到的 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。DNA 應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/ mL雙鏈DNA、40 μg/ mL單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為 1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響光吸收值，但并不表示純度低。

革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒 質(zhì)粒提取

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D9908  革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒小量提取試劑盒 Gram-positive Bacterium Plasmid Extraction Mini Kit  50T
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