Cas9（CRISPR相關(guān)蛋白9）是一種由RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶。這種酶與CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列）適應(yīng)性免疫系統(tǒng)相關(guān)，存在于多種細(xì)菌中，包括化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）。Cas9能夠解開外來(lái)DNA（如質(zhì)粒DNA或入侵噬菌體DNA），然后檢查是否存在與引導(dǎo)RNA的20個(gè)堿基間隔區(qū)互補(bǔ)的位點(diǎn)。如果DNA底物與引導(dǎo)RNA互補(bǔ)，Cas9會(huì)切割入侵的DNA。

Cas9蛋白因其作為基因組工程工具而引起全球關(guān)注，它能夠在DNA中引起定點(diǎn)的雙鏈斷裂。由此產(chǎn)生的DNA斷裂可以通過(guò)非同源末端連接和同源重組分別失活基因或引入異源基因，這在許多實(shí)驗(yàn)室模型生物中得到了應(yīng)用。此外，Cas9幾乎可以切割與其相關(guān)引導(dǎo)RNA互補(bǔ)的任何序列。在人類細(xì)胞中，已通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了基因敲除和基因替換。

圖1：CRISPR/Cas9 DNA編輯

艾美捷Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒是一種酶免疫測(cè)定法，用于檢測(cè)和定量細(xì)胞或組織裂解液樣本中的化膿性鏈球菌Cas9。該試劑盒的檢測(cè)靈敏度下限為1.5 ng/mL Cas9。每套試劑盒提供足夠的試劑，可進(jìn)行多達(dá)96次檢測(cè)，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和未知樣本。

Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒相關(guān)產(chǎn)品：

1. AKR-120：GFP定量試劑盒，熒光法  

2. AKR-121：GFP ELISA試劑盒  

3. AKR-122：RFP ELISA試劑盒  

4. AKR-130：His標(biāo)簽蛋白ELISA試劑盒  

Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒（#PRB-5079）組成：

盒子1（室溫運(yùn)輸）：

1. 抗Cas9抗體包被板（部件編號(hào)50791B）：一個(gè)96孔條板（8×12）。  

2. 生物素標(biāo)記抗Cas9抗體（1000倍稀釋）（部件編號(hào)50792C）：一個(gè)10 µL小瓶。  

3. 鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物（部件編號(hào)310803）：一個(gè)20 µL小瓶。  

4. 檢測(cè)稀釋液（部件編號(hào)310804）：一個(gè)50 mL瓶。  

5. 10倍洗液（部件編號(hào)310806）：一個(gè)100 mL瓶。  

6. 底物溶液（部件編號(hào)310807）：一個(gè)12 mL棕色瓶。  

7. 終止液（部件編號(hào)310808）：一個(gè)12 mL瓶。  

盒子2（藍(lán)色冰袋運(yùn)輸）：

1. Cas9標(biāo)準(zhǔn)品（部件編號(hào)50793D）：一個(gè)50 µL小瓶，含5 µg/mL重組化膿性鏈球菌Cas9。  

未提供材料：

1. 細(xì)胞或組織裂解液  

2. 含0.1% BSA的PBS  

3. RIPA緩沖液  

儲(chǔ)存：

收貨后，將Cas9標(biāo)準(zhǔn)品分裝并儲(chǔ)存于-80°C，以避免多次凍融循環(huán)。將生物素標(biāo)記抗Cas9抗體儲(chǔ)存于-20°C。將其他所有組分儲(chǔ)存于4°C。  

樣本準(zhǔn)備：

以下建議僅供參考，可根據(jù)用戶的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化或調(diào)整。  

- 細(xì)胞或組織裂解液：在裂解緩沖液（如RIPA緩沖液，25 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl，1% NP-40，1%牛磺膽酸鈉，0.1% SDS）中超聲處理或勻漿樣本，然后在4°C下以10,000 x g離心10分鐘。立即進(jìn)行檢測(cè)，或在-80°C下儲(chǔ)存樣本，最長(zhǎng)可達(dá)三個(gè)月。根據(jù)需要，將樣本稀釋于含0.1% BSA的PBS中。

檢測(cè)步驟：

1. 向抗Cas9抗體包被板中加入100 µL Cas9未知樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)Cas9未知樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照均需進(jìn)行雙份檢測(cè)。  

2. 在室溫下于軌道振蕩器上孵育1小時(shí)。  

3. 每孔加入250 µL 1倍洗液，洗滌微孔條3次，每次洗滌后c底吸干。最后一次洗滌后，倒空孔內(nèi)液體，并將微孔條在吸水墊或紙巾上輕拍以去除多余的1倍洗液。  

4. 向每孔中加入100 µL稀釋后的生物素標(biāo)記抗Cas9抗體。在室溫下于軌道振蕩器上孵育1小時(shí)。  

5. 按步驟3洗滌條孔3次。  

6. 向每孔中加入100 µL稀釋后的鏈霉親和素-酶偶聯(lián)物。在室溫下于軌道振蕩器上孵育1小時(shí)。  

7. 按步驟3洗滌條孔3次，然后立即進(jìn)行下一步。  

8. 將底物溶液平衡至室溫。向每孔（包括空白孔）中加入100 µL底物溶液，在室溫下于軌道振蕩器上孵育。實(shí)際孵育時(shí)間可能在2-30分鐘之間。  

注意：仔細(xì)觀察平板；如果顏色迅速變化，可能需要提前終止反應(yīng)，以防止飽和。  

9. 向每孔（包括空白孔）中加入100 µL終止液，終止酶反應(yīng)。結(jié)果應(yīng)立即讀?。伾珪?huì)隨時(shí)間消退）。  

10. 使用450 nm作為主波長(zhǎng)，在分光光度計(jì)上讀取每個(gè)微孔的吸光度。

Cas9(CRISPR相關(guān)蛋白9)ELISA檢測(cè)試劑盒文獻(xiàn)參考：

1. Heler, R; Samai, P; Modell, J. W.; Weiner, C; Goldberg, G. W.; Bikard, D; Marraffini, L. A.(2015). Nature. 519 :199–202.

2. Jinek, M.; Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A.; Charpentier, E. (2012). Science.337: 816–821.

3. Mali, Prashant; Esvelt, Kevin M; Church, George M (2013). Nature Meth. 10: 957-963.

4. Mali, Prashant; Aach, John; Stranges, P Benjamin; Esvelt, Kevin M; Moosburner, Mark; Kosuri,Sriram; Yang, Luhan; Church, George M (2013). Nature Biotech. 31: 833-838.

5. Gilbert, Luke A.; Larson, Matthew H.; Morsut, Leonardo; Liu, Zairan; Brar, Gloria A.; Torres,Sandra E.; Stern-Ginossar, Noam;Brandman, Onn; Whitehead, Evan H.; Doudna, Jennifer A.;Lim, Wendell A.; Weissman, Jonathan S.; Qi, Lei S. (2013). Cell. 154: 442-451.

6. Zheng Q, Cai X, Tan MH, Schaffert S, Arnold CP, Gong X, Chen C-Z, and Huang S. (2014)BioTechniques 57:115-124.