免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)有廣義和狹義之分,廣義的免疫沉淀包括特定目標蛋白質免疫沉淀(IP)、蛋白質復合物免疫沉淀(Co-IP)、染色質免疫沉淀(ChIP)和RNA免疫沉淀(RIP),狹義的免疫沉淀是指特定目標蛋白質的免疫沉淀,也就是常說的IP實驗,IP實驗可從含有多種不同蛋白質的樣品中分離濃縮特定的蛋白質。
免疫沉淀原理
免疫沉淀是一種利用特異性抗體結合抗原,并通過沉淀富集的方式從復雜的樣本中分離出目標蛋白的方法。主要用于從復雜的生物樣本中分離和純化單一特定蛋白質,依賴于抗體對目標蛋白的特異性識別并形成抗原-抗體復合物,然后通過物理方法(如瓊脂糖珠或磁珠 )將這些復合物沉淀下來,再結合Western blot(WB)或質譜(mass spectrum,MS)對目標蛋白進行檢測分析,即可對目標蛋白進行定性/定量分析。
磁珠的優勢
l 結合能力和得率
目前磁性微粒已經大幅取代瓊脂糖,成為免疫沉淀和其他微量親和純化方法的支持物。磁性微粒是球形固體,抗體結合于每個磁珠的表面。雖然磁珠不具有多孔中心以增加結合能力的優勢,但它們明顯小于瓊脂糖微珠(直徑0.2-4 μm),可提供足夠大的總表面積以滿足高容量的抗體結合,并且抗體很少會在溫和的洗滌步驟(磁體)中丟失。因此,盡管磁珠的抗體結合能力低于瓊脂糖,但最終的抗原得率通常與瓊脂糖相等或比瓊脂糖更高。
l 可重復性和純度
使用瓊脂糖時,難以在不破壞和靠近一些沉淀樹脂的前提下移除緩沖液。使用磁珠時,強力磁力架可將磁珠固定在管壁,所以無需碰觸磁珠沉淀即可移除緩沖液。此外,瓊脂糖通常需要較長的孵育時間(使溶液向內部空間的擴散)和預純化步驟(控制非目標蛋白的非特異性結合)。由于所有的相互作用均發生在磁珠的外表面,并且磁珠的尺寸更均一,所以磁珠的可重復性和純度通常高于瓊脂糖。
l 簡單、快速和自動化
瓊脂糖和磁珠之間的上述差異正是目前免疫沉淀優先選擇磁珠的原因。由于瓊脂糖免疫沉淀需要較長的孵育時間、預純化步驟和多次離心,所以其需要大量手動操作,總時間為1-1.5小時。相反,一次磁珠免疫沉淀使用只需大約30分鐘即可完成。此外,由于磁性分離不需要離心,在處理多個樣品時更簡單、更快速,更適合自動化。
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