BCA(Bicinchoninic Acid)法是一種常用的蛋白定量檢測方法,其原理是利用蛋白質與銅離子在堿性溶液中發生絡合反應,生成穩定的紫紅色復合物,再與標準曲線比較,即可求出待測蛋白的濃度。該方法具有靈敏度高、準確度高、操作簡便、抗干擾能力強等優點,廣泛應用于生物化學等領域。
實驗步驟:
1.試劑準備
(1)BCA工作液:將BCA試劑A和B按50:1的比例混合,充分搖勻,備用。
(2)標準蛋白溶液:取適量的標準蛋白,用PBS或去離子水溶解,配制成濃度為1mg/mL的標準蛋白溶液。
2.蛋白樣品制備
(1)細胞裂解:將細胞樣品離心,去除上清液,加入適量的細胞裂解液,在冰上裂解30min,使細胞充分裂解。
(2)去除雜質:將裂解后的樣品離心,去除沉淀,保留上清液。在上清液中加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,充分混勻。
(3)標準曲線制備:取適量的標準蛋白溶液,加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,然后分別稀釋成不同濃度的標準蛋白溶液。取96孔板,分別加入不同濃度的標準蛋白溶液,每個濃度設3個復孔。在每個孔中加入BCA工作液,充分混勻。然后按照說明書要求,在特定波長下測量吸光度值,繪制標準曲線。
3.蛋白定量檢測
(1)取適量的待測蛋白樣品,加入適量的SDS,使終濃度為0.1%,充分混勻。然后按照標準曲線的制備方法,加入BCA工作液,測量吸光度值。
(2)根據標準曲線,查找出待測蛋白樣品的濃度。如果待測蛋白樣品濃度較高,可以進行適當稀釋后再進行測定。
注意事項:
1.BCA工作液應儲存于4℃避光保存,避免反復凍融。
2.實驗過程中應保持樣品和標準蛋白溶液的pH值一致,以保證結果的準確性。
3.在實驗過程中應避免交叉污染,以免影響實驗結果。
4.對于一些特殊的蛋白質樣品,可能需要采用其他方法進行定量檢測。
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