IPS誘導腸類器官培養分為三大階段：人多能干細胞的培養、內胚層分化及中/后腸模式化誘導、類器官培養。

內胚層分化及中/后腸模式化誘導

一、前期準備

1、試劑與設備

   - 細胞：H1/H9 hESC或患者來源iPSCs。  

   - 培養基：人多能干細胞培養基(abs9403)、RPMI 1640(abs9484)。

   - 消化液：人多能干細胞消化液(abs9409)

   - 培養基添加劑：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)(abs9295)、雙抗(abs9244)

   - 生長因子：Activin A(100ng/mL)(abs05801)、FGF4(500ng/mL)(abs06269)、WNT3a(500ng/mL)(abs05632)。  

   - 基質膠：即用型基質膠（培養板包被）(abs9410)、類器官專用基質膠(abs9495)。

   - 血清：透析胎牛血清(abs945)

   - 關鍵設備：表面培養皿、立體顯微鏡、無菌手術刀、預冷微量離心管。 

2、試劑配制

   - 內胚層分化培養基：  

     - Day1：RPMI 1640+L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(2mM)+雙抗(1%)+Activin A(100ng/mL)。  

     - Day2：Day1配方+透析胎牛血清(0.2%)。  

     - Day3：Day1配方+透析胎牛血清(2%)。  

   - 中/后腸分化培養基：

     -RPMI 1640+透析胎牛血清(2%)+FGF4(500ng/mL)+WNT3a(500ng/mL)。

二、hPSCs傳代與鋪板

1、細胞傳代（耗時2h）  

   - 使用人多能干細胞消化液消化hPSCs至邊緣卷起。  

   - 用細胞刮刀輕柔剝離細胞團，反復吹打至1-2mm大小細胞團。  

   - 按1:6比例接種至Matrigel包被的24孔板（每孔約5000個細胞團）。  

   - 輕敲培養板使細胞均勻分布，37°C過夜培養。  

2、細胞擴增至85-90%融合（3-4天）  

   - 每日更換人多能干細胞培養基，觀察細胞密度。  

   - 關鍵：密度過高（自發分化）或過低（分化效率低）需重新鋪板。

三、內胚層分化（3天）

1、Day1：吸除人多能干細胞培養基，加入Day1內胚層培養基（無血清），培養24h。  

2、Day2：更換為Day2內胚層培養基（含0.2%透析胎牛血清），培養24h。  

3、Day3：更換為Day3內胚層培養基（含2%透析胎牛血清），培養24h。  

4、驗證分化效率（可選）：  

   - 免疫染色檢測FOXA2/SOX17雙陽性細胞（效率應達85-90%）。

四、中/后腸模式化（3-4天）

1、誘導球狀體形成

   -吸除內胚層培養基，加入中/后腸分化培養基，每日更換。  

   -48h后：立體顯微鏡下觀察上皮增厚，72-96h球狀體(spheroids)脫離單層細胞。  

2、收集球狀體

   -用200μL槍頭收集游離球狀體，每管約50個，置于冰上備用。

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