JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis

KWS：JAG1-NOTCH4；mechanosensing；atherosclerosis

血流產生機械剪切應力，通過改變血管內皮細胞（ECs）的生理機能，對血管功能產生深遠影響。具有均勻幾何形狀的動脈樹區域受到單向的高生理剪切應力，發揮EC 保護作用并防止動脈粥樣硬化的發生。然而，動脈的分支和彎曲部分暴露于復雜的血流模式中，產生方向變化的低平均剪切應力（如雙向振蕩和渦流），這些紊亂的血流條件會促進 EC 功能障礙和動脈粥樣硬化的發生。

Notch 信號通路在調控細胞進程、調節細胞命運方面起至關重要的作用。哺乳動物中有四個受體（Notch1-4）和五個配體（Delta-like（DLL）1，3，4和Jagged（Jag）1-2）。經典研究表明，相鄰 EC 上 NOTCH1及其配體DLL4 之間的相互作用在血管生成過程中建立了“前端”與“柄”細胞身份，并且 NOTCH1 和 DLL4 通過抑制缺血組織中的 EC 增殖和新生血管形成對動脈功能至關重要。Notch 的激活需要配體內吞作用誘導的機械力，而NOTCH1 對剪切應力的感應在動脈分化和血管穩態保護中起重要作用。然而，Notch 系統在致動脈粥樣硬化擾動流的 EC 傳感中的潛在作用尚未得到研究。

基于此，英國謝菲爾德大學感染、免疫和心腦血管疾病系、中國西南醫科大學藥學院及美國芝加哥大學生物醫學科學系等研究團隊曾利用幾種互補的實驗方法（豬動脈、實驗血流修飾的小鼠動脈和培養的人EC）表明了擾動流主要激活 JAG1-NOTCH4 通路。其條件性基因缺失表明，Jag1 特別是在易患病的血流紊亂區域增強動脈粥樣硬化；單細胞 RNA 測序和其他機制方法表明，JAG1-NOTCH4 信號通過抑制對增殖至關重要的 EC 亞群來促進動脈粥樣硬化。這些數據從根本上推進了我們對 Notch 信號在解釋剪切應力信號控制 EC 功能中的作用的認識，并對動脈粥樣硬化中 Notch 通路的治療靶向具有重要意義。研究成果發表在 Science Advances 期刊題為“JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis”。

實驗假設 Notch 受體和配體在暴露于不同流動條件的動脈位置可能具有不同的空間表達模式，通過qRT-PCR分析對從暴露于受干擾的低振蕩剪切應力（LOSS）或高剪切應力（HSS）的區域分離的豬主動脈 EC 中 Notch 受體及其配體的轉錄物表達水平，發現與 HSS 相比，JAG1 和 NOTCH4 mRNA 在 LOSS 位點的表達顯著增強，而 JAG2、DLL1、DLL3、DLL4、NOTCH1、NOTCH2 和 NOTCH3 的表達在這些位點之間相似（圖1 A）。

然后，量化小鼠主動脈弓中 JAG1 和 NOTCH4 蛋白的表達。表面染色顯示，與小鼠主動脈弓中的 HSS 區域相比，JAG1 和 NOTCH4 蛋白在 LOSS 區域的表達水平更高（圖1 B、C）。利用免疫熒光光片成像技術對高膽固醇血癥載脂蛋白E（ApoE）-/- 小鼠的病變動脈區域進行分析發現，與相鄰的非斑塊區域相比，JAG1 和 NOTCH4 在動脈粥樣硬化斑塊區域富集，表明其在動脈粥樣硬化中具有潛在作用（圖1 D）。這些數據表明，JAG1 和 NOTCH4 在動脈粥樣硬化易感部位的內皮細胞和動脈粥樣硬化斑塊中富集。

使用收縮袖帶改變小鼠頸動脈的血流在下游產生振蕩剪切應力，評估JAG1 和 NOTCH4 是否直接對剪切應力敏感，結果顯示，14 天后下游區域的 JAG1 和 NOTCH4 顯著增強（圖1 E、F）。相比之下，JAG1 和 NOTCH4 的表達在具有生理血流的對側動脈中幾乎檢測不到。因此，JAG1 和 NOTCH4 在袖帶內曲率和下游區域的富集可能是對 LOSS 的反應。

圖1    JAG1和NOTCH4在動脈粥樣硬化傾向位點富集。

進一步地，分析人冠狀動脈EC（HCAEC）對血流（LOSS：±4 dyne/cm2，0.5 Hz；HSS，13 dyne/cm2）的反應。Notch 配體 JAG1、JAG2、DLL3 和 DLL4 的 mRNA 水平因 HCAEC 中的剪切應力而顯著改變，其中 JAG1 在 LOSS 下表達最高（圖2 A）。此外，JAG1 是在蛋白質水平上持續被 LOSS 增強的 Notch 配體（圖2 B），但DLL4 蛋白未受流動影響（圖2 B）。在 Notch 受體中，NOTCH4 在 mRNA（圖2 A）和蛋白質（圖2 C）水平上都因 LOSS 而增強，這與信號轉導增加有關，NOTCH4活性和裂解的胞內結構域（N4ICD）增加證明了這一點（圖2 C、D）。暴露于靜態條件下的 HCAEC 中的 JAG1 和 NOTCH4 mRNA 水平較低，證實它們具有流動響應性。這些數據表明，JAG1 和 NOTCH4 是暴露于 LOSS 的人 EC 中的主要 Notch 成分，這與體內研究一致。

此外，使用 JAG1 的活性阻斷抗體和 DLL4 阻斷抗體作為對照進行比較，研究了 JAG1 是否在 LOSS 下作用于 NOTCH4 的上游。在暴露于 LOSS 的 HCAEC 中，阻斷 JAG1 顯著降低了 N4ICD 激活，而阻斷 DLL4 活性沒有顯著影響（圖2 E）。anti-JAG1 或 anti-DLL4 阻斷抗體未改變 NOTCH4 mRNA 的總水平。這些數據表明，JAG1 激活NOTCH4 是 LOSS 條件下的關鍵通路。

圖2   JAG1-NOTCH4通路是由LOSS體外誘導的。

接下來，為了描述內皮 Jag1 在動脈粥樣硬化中的作用，生成 EC 特異性Jag1 敲除小鼠，并暴露于高脂飲食產生高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化病變（圖3 A、B）。在高膽固醇血癥小鼠中，與對照組相比，Jag1^ECKO 小鼠整個主動脈的病變面積顯著減少（圖3 C、D）。進一步分析顯示，Jag1^ECKO  導致主動脈弓病變面積減少，但降主動脈（圖3 D）病變面積未減少，主動脈根部的病變區域也沒有改變（圖3 E、F）。因此，Jag1 在具有特定流動條件的解剖學不同部位上促進動脈粥樣硬化，尤其是在血流紊亂部位。

圖3   內皮細胞Jag1的缺失減少了主動脈弓斑塊的形成。

最后，為了闡明 JAG1 依賴性動脈粥樣硬化的潛在機制，對對照和Jag1ECKO 主動脈進行scRNA-seq。SORT-seq 分析確定了 14 個不同的集群。其中，簇 0-11 一致表達多種 EC 標志物，與以前發表的小鼠主動脈的 EC 簇非常相似。這些觀察結果證實了正常小鼠主動脈中存在異質性。簇 4-6 中的大多數細胞來自 Jag1ECKO 小鼠，而簇 2 和 7-11 的細胞主要來自對照小鼠，表明 Jag1 對 EC 異質性有深遠的影響。特別是，與細胞增殖和遷移相關的多個 GO terms 在 Jag1ECKO 小鼠富集，表明 Jag1 抑制參與增殖和遷移的 EC 亞型。

然后，分析了體外暴露于 LOSS 的 HCAEC 中的 JAG1 功能。RNA-seq 顯示 859 個基因因抑制 JAG1 而顯著改變，DAVID功能注釋發現，最高度富集的 GO terms 集中在細胞分裂過程和細胞分裂/遷移（圖4 A-C）。因此，確定 JAG1 是 EC 增殖的調節因子。通過使用基因沉默或活性阻斷抗體抑制 JAG1-NOTCH4 通路可顯著增強 LOSS 下的 HCAEC 增殖和遷移，證實了這一聯系（圖4 D、E）。此外，pan-Notch 抑制劑DAPT 增強了暴露于 LOSS 的 HCAEC 的增殖，這與 JAG1 水平降低相關，而 DLL4 沒有改變，從而進一步證實了擾動流下 JAG1、Notch 與增殖之間的聯系。同樣，Jag1 的缺失導致暴露于 LOSS 的小鼠主動脈區域的 EC 增殖增加（圖4 F），但不影響暴露于 HSS 的區域的 EC 增殖。因此，JAG1-NOTCH4 通路在擾動流下抑制了增殖和遷移。

為了研究 JAG1 的作用是否具有細胞自主性，分析了 JAG1 沉默細胞是否可以影響共培養細胞的增殖，結果發現，處理細胞的增殖均顯著增強，表明 JAG1 通過非細胞自主機制驅動增殖，其機制可能涉及細胞間接觸。這些數據表明，JAG1-NOTCH4 的LOSS 感應通過改變 EC 異質性以抑制控制增殖和遷移的 EC 亞群來增強疾病易感性。

圖4    LOSS激活JAG1導致內皮修復受到抑制。

圖5    動脈粥樣硬化中JAG1-NOTCH4 控制修復性內皮亞群的假設。

實驗假設 LOSS 激活 JAG1-NOTCH4 信號，通過改變修復性和致病性 EC 亞群的平衡來促進動脈粥樣硬化。

總之，JAG1-NOTCH4 對 LOSS 的感應通過改變 EC 異質性促進動脈粥樣硬化，實驗假設該通路抑制了負責血管修復的亞群。這些數據表明，JAG1-NOTCH4 在感知疾病引發的 LOSS 中具有重要作用，并表明 JAG1-NOTCH4 的治療靶向可能是一種新的治療策略，可增強修復性 EC 亞群以預防或治療動脈粥樣硬化。

參考文獻：Souilhol C, Tardajos Ayllon B, Li X, Diagbouga MR, Zhou Z, Canham L, Roddie H, Pirri D, Chambers EV, Dunning MJ, Ariaans M, Li J, Fang Y, J?rgensen HF, Simons M, Krams R, Waltenberger J, Fragiadaki M, Ridger V, De Val S, Francis SE, Chico TJ, Serbanovic-Canic J, Evans PC. JAG1-NOTCH4 mechanosensing drives atherosclerosis. Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7958. doi: 10.1126/sciadv.abo7958. Epub 2022 Aug 31. PMID: 36044575; PMCID: PMC9432841.

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