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實驗材料：
1.cDNA樣本：通過上游反轉錄反應得到的cDNA。
2.熒光定量試劑：Hieff UNICON® ColorGPS qPCR SYBR Green Master Mix (No/Low/High Rox)。
3.其他試劑：RNase-free H2O、相關基因上下游引物(儲存濃度10 μM)。
4.設備與耗材：移液器、qPCR儀、冰盒、離心機、RNase-free八連排、RNase-free離心管。
實驗步驟：
試劑&樣本前期準備
試劑解凍和混勻
從冰箱中取出：
從-20℃冰箱中取出含酶試劑，立即放入冰盒中（冰上操作）；
避免將試劑直接放在室溫下解凍，以免溫度波動影響酶的活性。
緩慢解凍：
讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘；
如果需要快速解凍，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱。
輕輕顛倒混勻：
解凍后，將試劑管輕輕上下顛倒幾次，使試劑充分混勻；
避免劇烈震蕩或渦旋混勻，以免破壞酶的活性。
低速離心：
將試劑管短暫離心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管蓋上的液體集中到管底；
離心后再次輕輕混勻，確保試劑均勻分布；
混勻后的試劑應繼續放在冰上，避免長時間暴露在室溫下。
Tips：混勻時盡量避免產生氣泡，氣泡可能會影響酶的活性或實驗結果的準確性。
模板稀釋(若需要)
稀釋步驟
若需追蹤模板，按以下步驟稀釋：
取1 μL 10×Dilution Buffer + 9 μL無菌超純水 → 配制1×Dilution Buffer；
用1×Dilution Buffer稀釋cDNA至目標濃度（建議稀釋至Ct值20-30的范圍內）。
若無需追蹤模板，直接用無菌超純水稀釋cDNA或者直接使用cDNA原液。
熒光定量PCR反應體系配制
常見的熒光定量儀器為96孔反應，大體分為12列×8行。舉例說明：
備注說明：
相對定量分析基因表達情況時，為排除樣本和操作的影響，對數據進行歸一化，需要有內參基因，例如GAPDH、β-actin等等。
技術重復通常建議設置3孔，為保證后續取平均值或剔除異常值。當然根據自己的需求進行調整，設置2孔重復或者4孔重復均可。
依據MIQE準則，NTC(陰性對照)建議設置，一方面用于污染風險判斷，另一方面其也是一套實時熒光定量 PCR (qPCR) 實驗設計及數據報告實踐指南以及與發文共享實驗信息的標準。
熒光定量PCR體系（大體系配制減少誤差）
以上述投入2μL cDNA模板檢測不同樣本基因1為例：
將上述溶液依次加好后，將管蓋蓋嚴，用手輕彈管壁，使各組分充分混勻，再放入小型離心機，短暫離心1-2s，再次輕彈管壁（防止有氣泡），瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）并置于冰/冰板上。
備注：如使用顯蹤劑建議模板投入體積控制在2-5 μL，以保證顯蹤效果，如使用cDNA母液建議投入體積控制在2 μL(反應體系的1/10)以內防止影響擴增效果。
按照上機儀器選取對應耗材（八聯排或96孔板）。
在對應耗材中按照布板依次分裝18μL/孔步驟1)配置的大體系Mix。
在每個孔中加入2 μL對應模板。
移液槍加樣Tips(吸一排二)：
吸取液體：緩慢、平穩地按下按鈕至第一檔(不是按到底)，然后將吸頭浸入液面下，然后緩慢、平穩地松開檔位至原位來吸取液體。注意不要讓吸頭接觸到容器的邊緣或底部，以防止污染。
液體排出：將吸頭對準接收容器，然后緩慢、平穩地按下按鈕至第二檔(按到底)以排出液體。確保所有的液體都被排出。
完成加樣后，將管蓋蓋嚴，用手輕彈管壁，使各組分充分混勻，再放入小型離心機，短暫離心1-2s，再次輕彈管壁（防止有氣泡），瞬間離心（防止部分溶液沾到管壁上）確保無氣泡后置于潔凈的96孔PCR管架。
備注：注意觀察每一槍是否吸到了氣泡，若出現氣泡吸取則會導致實驗數據出現較大偏差。
熒光定量PCR上機運行
上機前，仔細檢查管子，確保正上方管蓋、管身沒有記號筆染料，管內無氣泡、管壁無液體。
若采用常規程序，則進行以下設置：
備注：
不同熒光定量qPCR試劑核心的酶和Buffer組成都存在差異，對應說明書上的程序是該產品大多數情況下的最適反應條件，建議按照說明書的程序進行儀器設置，減少因用其他程序帶來的數據偏差；
熔解曲線程序可選用儀器默認程序。
備注：以ABI Q5常規程序為例，在進行程序設置時，確保在退火/延伸階段和熔解曲線的升溫階段打開數據信號收集開關。
若采用快速程序，需確認儀器本身是否可以快速升降溫，運行快速程序。以下以ABI Q5為例：
結果判定
觀察熔解曲線峰是否單一。
初步判斷復孔間Ct值差距是否＜0.5，或者進一步計算復孔間CT值STD是否＜0.2。
內參基因Ct值盡量在14-25之內，不要過小也不要過大。
數據分析
下機得到的Excel數據處理如下：
圖示說明：
④：對照組校正后的數值；
③/④：每個小組校正后的數值比上對照組校正后的數值；
意圖表上的數據在excel中采用了保留2位小數的形式，實際計算時不可忽略小數點后的所有數字，減少按數字的動作，活用Excel。
注意事項
1、引物設計好壞對于最終實驗的成功和實驗結果都會有一定的影響，可參考干貨軟文，解鎖更多引物設計寶藏。
2、長時間放置的引物，建議嘗試先用預實驗(跟著其他實驗或人帶上幾孔測測看)，避免直接進行大規模正式實驗，從而造成不必要的風險損失。
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