FAK regulates cardiomyocyte mitochondrial fission and function through Drp1

Keywords: Drp1; FAK; fibronectin; mitochondrial fission.

線粒體對于心肌細胞的能量產生至關重要，其功能障礙與心力衰竭的發展密切相關。線粒體代謝功能與裂變和融合調控的線粒體動力學有關。在哺乳動物細胞中，線粒體裂變需要動力蛋白相關蛋白1（Drp1）。Drp1 是一種由其受體募集到線粒體外膜的 GTP 酶，并參與線粒體膜斷裂。在新生大鼠心室肌細胞（NRVMs）中，Drp1 的缺失會累積損傷的線粒體，減少細胞內 ATP，并導致細胞凋亡。心肌組織特異性 Drp1 敲除小鼠的心力衰竭表型也證明了 Drp1 在維持正常心臟功能中的作用。

Drp1 對線粒體裂變功能的調控涉及各種翻譯后修飾，包括第616位點絲氨酸（S616）的磷酸化，Drp1 S616 的磷酸化促進 Drp1 的線粒體募集。研究發現，腎上腺素能受體（AR）激動劑增加了 NRVMs 中 Drp1 S616 的磷酸化，誘導線粒體裂變，而Drp1 抑制劑可減少 AR 激活誘導的心肌細胞肥大。此外，在壓力超負荷的小鼠心臟中也觀察到 Drp1 S616 磷酸化的增加。然而，Drp1 S616 磷酸化在心肌細胞中的上游調控通路和線粒體代謝功能尚不清楚。

基于此，中國臺灣省中央研究院生物醫學科學研究所的科研團隊在一項研究中探討了參與調控心肌細胞 Drp1 磷酸化、線粒體形態、線粒體代謝功能和能量產生的細胞內信號通路和細胞外因子，并最終證明了細胞外纖連蛋白和腎上腺素刺激通過 FAK-ERK1/2-Drp1 通路來調控心肌細胞中的線粒體形態和功能。研究成果發表在 The FEBS Journal 期刊題為“FAK regulates cardiomyocyte mitochondrial fission and function through Drp1”。

首先，對 NRVMs 進行 6 或 24 h 的循環拉伸（10%，1 Hz）以評估 Drp1 介導的線粒體裂變在機械拉伸誘導的心肌細胞肥大中的作用。結果發現，6 h的循環拉伸導致 NRVMs 中的線粒體呈現更小和更碎片化的形態，當循環拉伸的持續時間延長至 24 h時，NRVMs 的細胞體積顯著增大，線粒體體積減小（圖1 A-C）。此外，在循環拉伸前用 Mdivi-1 處理 NRVMs 以抑制 Drp1 介導的線粒體裂變，發現循環拉伸24 h后細胞面積增加，Mdivi-1 預處理以阻斷 Drp1 活性可降低機械循環拉伸誘導的心肌細胞肥大（圖1 D）。顯性-陰性Drp1（Drp1-K38A）的表達也抑制了循環拉伸誘導的NRVMs 細胞體積大增大（圖1 E）。

以往的研究發現，早期粘著斑激酶（FAK）的激活會影響拉伸的 NRVMs 的肥大相關基因的誘導。因此，實驗評估了 Drp1 活性對循環拉伸誘導的早期基因表達的影響，發現 6 h 的循環拉伸增加了 NRVMs 中腦利鈉肽（BNP）和 c-Jun mRNA 的表達，但Mdivi-1 又降低了 BNP 和 c-Jun 的誘導（圖1 F）。這表明，Drp1 介導的線粒體裂變調節機械拉伸誘導的 NRVMs 心肌細胞肥大。

研究人員假設機械拉伸通過 FAK 促進 Drp1 介導的線粒體裂變。結果發現，與未拉伸的對照組相比，NRVMs 在循環拉伸6 h后線粒體體積顯著減小。用 Drp1 或 FAK 抑制劑（PF573228）處理 NRVMs，發現其可阻止循環拉伸誘導的線粒體體積減小。這表明Drp1 和 FAK 對于心肌細胞中循環機械拉伸誘導的線粒體裂變很重要。進一步研究它們在 NRVMs 中的細胞內分布，發現 GFP-FAK 在線粒體外膜上靠近 Drp1，且在 NRVMs 的線粒體部分檢測到內源性 FAK。這些結果表明，FAK 參與線粒體裂變，并且在空間上接近 NRVMs線粒體中的 Drp1。

Drp1 的磷酸化調節 Drp1 的線粒體裂變能力。已在壓力超負荷的小鼠心臟中觀察到 FAK 的早期激活和 Drp1 磷酸化的誘導。因此，實驗假設 FAK 參與調節心肌細胞中 Drp1 的磷酸化，通過使用 PF573228 抑制 FAK 活性并測量 pY397 FAK 和 pS616 Drp1 的水平。結果發現，FAK 抑制劑減弱了 NRVMs 中 FAK 自磷酸化信號（pY397），且呈劑量和時間依賴性地降低NRVMs 中Drp1 S616的磷酸化。此外，循環拉伸增加了 Drp1 S616 的磷酸化，而用 FAK 抑制劑預處理降低了 NRVMs 中拉伸誘導的 Drp1 S616 磷酸化。通過在循環拉伸的NRVMs 中表達Drp1 的顯性陰性 K38A 突變體和在 NIH3T3 細胞中敲低 FAK，進一步確認線粒體裂變與FAK 在調節 Drp1 S616 磷酸化中的作用，證明了FAK 通過影響 Drp1 S616 磷酸化參與調節 Drp1。

圖1    拉伸誘導的線粒體裂變先于并調節心肌細胞肥大。

ECM 蛋白纖連蛋白的表達在肥大性心肌組織中增加。接下來，實驗測試了纖連蛋白是否可以激活 FAK，然后調節 NRVMs 中 Drp1 的磷酸化。結果表明，用纖連蛋白培養的 NRVMs 中 FAK Y397 和 Drp1 S616 的磷酸化增加（圖2 D），因此纖連蛋白可以激活心肌細胞中的 FAK 和 Drp1 信號通路。與對照組相比，含纖連蛋白的 NRVMs 的線粒體中 Drp1 水平增加（圖2 B），且線粒體形態更加碎片化，體積更小（圖2 C、D）。這表明，纖連蛋白可以激活 FAK，從而導致 NRVMs 中 Drp1 S616 的磷酸化和線粒體裂變。

先前的研究表明，ERK1/2 通過磷酸化 Drp1 的 S616 位點來調節線粒體裂變。因此，實驗測試了 FAK 是否通過 ERK1/2 調節 Drp1，發現用纖連蛋白培養的 NRVMs 中 ERK1/2 的磷酸化（ERK 激活的標志）水平增加（圖2 A）。FAK 抑制劑PF573228降低 NRVMs 中 Drp1 S616 和 ERK1/2 的纖連蛋白依賴性磷酸化（圖2 E）。此外，還用 MEK 抑制劑 U0126 處理細胞，以防止 ERK1/2 的磷酸化和激活，發現U0126 降低了 Drp1 S616 的磷酸化，但不影響 pFAK Y397，因此在纖連蛋白培養的 NRVMs 中，ERK1/2 激活可能位于 FAK 的下游（圖2 E）。同時，還表達并下調了FAK 和 ERK1/2 抑制劑處理的 NRVMs中的 Drp1-K38A 突變體，發現Drp1-K38A 突變體的 S616 磷酸化也被 PF573228 和 U0126 抑制（圖2 F）。這些結果表明，細胞外纖連蛋白通過 FAK-ERK1/2-Drp1 信號通路促進心肌細胞線粒體裂變。

然后，通過測量纖連蛋白培養的 NRVMs 的總 ATP 水平和耗氧率（OCR）進一步研究 FAK-ERK1/2-Drp1 信號通路在線粒體呼吸和能量產生中的作用，結果表明，FAK-ERK1/2-Drp1 信號通路參與心肌細胞能量代謝，抑制該通路會導致心肌細胞能量不足。

圖2 纖連蛋白激活的 FAK 通過細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）參與小鼠心肌細胞中 Drp1 介導的線粒體裂變。

心肌細胞中存在急性線粒體代謝-收縮偶聯（metabolic?contraction coupling）。AR 激活后，心肌細胞增加線粒體代謝功能，以匹配收縮力增強的能量需求。之前發現在膠原蛋白上培養的 NRVMs 在 AR 刺激后具有 Drp1 依賴性耗氧率（OCR）增加。因此，實驗在最后也檢查了 FAK-ERK1/2 是否也在急性 AR 誘導的收縮應激下的代謝適應中發揮作用。

用去氧腎上腺素（PE）激活 AR以研究FAK 和 ERK1/2 在明膠培養的 NRVMs 中的作用。結果發現，PE 增強了明膠表面 NRVMs 的 OCR，抑制 FAK 和 ERK 降低了PE 刺激的 OCR（圖3 A）。用線粒體 ATP 合酶抑制劑寡霉素（Oligomycin）處理后，所有實驗組PE 刺激的 OCR 均逆轉到基礎水平，這表明增加的 OCR 用于線粒體 ATP 合成（圖3 A）。然而，在 PF573228 和 U0126 處理的 NRVMs 中，寡霉素-敏感的 OCR 較低 （圖3 B）。這些結果表明，PE 誘導的 OCR 是由 FAK- 和 ERK1/2- 依賴性通路介導的，以增加心肌細胞中線粒體 ATP 的合成。

繼續研究纖連蛋白對 NRVMs 中 AR 誘導的 OCR 的影響。當 NRVMs在纖連蛋白上培養時，PE 刺激未能增加 OCR（圖3 C）。研究人員假設 AR 和纖連蛋白使用相同的下游 Drp1 來調節 NRVMs 的 OCR，一旦纖連蛋白占據了 Drp1，活化的AR 就無法使用它。因為纖連蛋白通過 FAK-ERK1/2-Drp1 信號通路調節 NRVMs 的 OCR，所以研究了 AR 激動劑刺激后該通路的激活。在明膠培養的 NRVMs 中，PE 增加了ERK1/2 和 Drp1 S616 的磷酸化，PF573228 預處理可降低PE 誘導的 Drp1 和 ERK1/2 磷酸化，U0126 預處理可降低 PE 誘導的 Drp1 磷酸化（圖3 D）。然而，在纖連蛋白加明膠培養的 NRVMs 中，PE 未能增加 Drp1 S616 的磷酸化（圖3 E）。這些結果表明，細胞外纖連蛋白通過限制 Drp1 的磷酸化來限制腎上腺素能激動劑誘導的NRVMs 呼吸。

圖3    FAK、ERK1/2 和 Drp1 參與腎上腺素能激動劑對心肌細胞呼吸的快速誘導。

總之，這項研究證明了 FAK 通過下游 ERK 激活和 Drp1 磷酸化調節心肌細胞線粒體形態和功能。通過調節線粒體呼吸和 ATP 生物合成，FAK 在各種條件下對心肌細胞的能量生成進行急性調控；通過調節 FAK-ERK1/2-Drp1 通路，心肌細胞對 ECM 蛋白變化、腎上腺素能激素刺激和機械拉伸誘導的壓力進行代謝適應。該細胞模型提供了對心肌細胞中 Drp1 調控的分子機制的見解，并可能解釋心肌肥大的病理結果。

參考文獻：Chang YW, Song ZH, Chen CC. FAK regulates cardiomyocyte mitochondrial fission and function through Drp1. FEBS J. 2022 Apr;289(7):1897-1910. doi: 10.1111/febs.16263. Epub 2021 Nov 19. PMID: 34739186.

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