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近日，陶氏化學與安捷倫基于 1290 UHPLC 系統合作開發了一種溶于二氯甲烷（DCM）中且濃度低至 ppb 級別的雙酚 A 及其二縮水甘油醚衍生物混合物檢測方法，該套設備采用了具有 feed 進樣模式的 hybrid multisampler，在該進樣模式下，樣品以一定的進樣速度注入流動相中，因此暫時稀釋樣品，克服了溶劑效應，同時進樣量可高達 45 μL，這種新的進樣方法顯著提高了目標物質的檢測限（>20×）。
消費后再生材料（PCR）在消費品中的使用正在增長，而 PCR 必須滿足金屬和有機成分的法規要求，或通過與應用相關的產品安全風險評估。有機成分通常包括專門添加的提高產品性能的物質（如抗氧化劑）和非添加的物質（NIAS），其中非添加物質（NIAS）包括了不同來源的幾類有機物質，如污染物和降解物，可能對人體有害。
針對高分子量、非揮發性或者熱不穩定的 NIAS，通常使用強溶劑（如二氯甲烷（DCM））提取樹脂，然后使用反相液相色譜（RPLC）分析。強有機溶劑在提取塑料材料中 NIAS 時最具效力，但它們通常對 RPLC 的應用具有挑戰性。因為 NIAS 的組成可能會因塑料類型和 PCR 的來源而有很大差異，為了在 PCR 非靶向分析中涵蓋極性、疏水性和官能團方面的廣泛有機分子，通常采用 C8 或 C18 作為固定相，流動相會從高比例水起始，到高比例有機改性劑（如乙腈或甲醇）結束來實現梯度洗脫，而當樣品的溶劑（如二氯甲烷）洗脫強度遠大于初始流動相組成的溶劑洗脫強度時，會對峰寬和峰形產生不利影響，尤其是對于早洗脫峰而言。
本文選擇 DCM 制備的濃度為 10 ppm 的雙酚 A（BPA）和 6 種雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的混合物作為樣品，首先采用經典流通式進樣模式，發現不同進樣量和梯度洗脫中等度保持的流動相初始比例差異會帶來明顯的色譜圖結果差異，見圖 1。
圖 1.（A）使用 FT 進樣時，進樣體積為 2 μL 至 10 μL 時的色譜圖比較。將等度保持設置為 10% B（深藍色）或 20% B（淺藍色）3 min，然后開始梯度，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。
實驗表明，經典的流通式進樣模式下，只有進樣量為 2 μL 時，才能獲得合適的峰形和分離度，結合使用高靈敏度 DAD 也不能獲得足夠的檢測限。而在 5 μL 和 10 μL 進樣體積下，乙腈濃度從 10% 增加到 20%，各峰形及分離度均不佳，這主要是因為分析物溶解在 DCM 中，進樣體積增加，導致分析物在柱頭上的捕獲更不充分，可見進樣體積對分析物聚焦有很大影響。
針對這類樣品，傳統解決溶劑效應的方式有：
1、使用較弱的混溶溶劑稀釋樣品溶液；
2、降低進樣體積；
3、三明治進樣或 co-injection 技術。
三明治進樣或 co-injection 技術，是在吸樣之前抽取一段水填充 Loop，使樣品通過低洗脫溶劑聚焦在柱頭上或是使用進樣程序將樣品與初始流動相混合，從而降低樣品溶劑的整體強度。顯然，這兩個想法可以結合起來，并且可以調整其中吸入的液體的組成以獲得最佳結果。遺憾的是，樣品定量環中需有額外的溶劑填充，而這些進樣技術的最大進樣體積有限。以上這些方法即使讓峰形有所改善，也都會導致方法檢測限受到影響。當然除了以上方法外，若有更合適的溶劑可選，可蒸發強溶劑并用新的溶劑重新溶解分析物，但其過程可能很費力并且可能造成分析物損失。也有文獻中表示可采用在線固相萃取方式，trap 柱捕獲分析物，隨后在分析色譜柱上進行分離，但是這需要更復雜的儀器硬件和至少兩根填料色譜柱，方法優化復雜，還需考查回收率等。
安捷倫 G7167C hybrid multisampler 除了經典流通式進樣模式（FT）外，還具有全新的 feed 進樣模式（FI）。feed 進樣模式可以減少樣品溶劑對分析物的洗脫，因為它使得樣品溶劑與洗脫液在柱前混合，這種短暫的稀釋與初始條件下分析物被色譜柱充分捕獲相結合，允許我們使用非常強的樣品溶劑，且不會產生額外的峰展寬或畸變。兩種注射方法的原理如圖 2 所示，在流通式進樣時，通過切換自動進樣器的進樣閥，存儲在自動進樣器樣品定量環中的樣品將會成為流路的一部分，以“液塞”的形式被流動相帶入色譜柱。采取 feed 進樣模式，樣品會以一定速率（feed 速度）不斷被打入系統，在 feed 進樣期間，液相輸液泵流量會因有來自于進樣器的流量而減少，從而可以保持總流速不變。
圖 2. 樣品注入原理。(A) 流通式進樣 FT；(B) Feed 進樣 FI；流動相（橙色）的流向為從左往右，樣品（藍色）
FEED 進樣速度的優化
該實驗中，作者對比了進樣器不同設置下進樣 10 μL 樣品所得的色譜圖。在圖 1 中，20% 高乙腈濃度與 FT 注射相結合時會導致所有峰的干擾，但從圖 3 中看到，當采用 feed 進樣模式，使用 1% feed 速度時，峰 2-7 峰形及分離度顯著改善。同時，從圖 3A 可以看出 feed 進樣模式下 feed 速度的設置很關鍵，會直接影響色譜分離效果，對比 10% 乙腈的等度保持分離的色譜圖可以看出，進料速度為 10% 的 feed 進樣與 FT 進樣相比顯然沒有優勢。但是隨著 feed 速度從 10% 逐漸調整到 0.5% 時，化合物 2 的峰寬降低至 0.113 分鐘，同時，峰對（峰 3 和 4）和三重峰（峰 5-7）的分辨率顯著提高，如圖 3B 所示。進料速度從 1% 降低到 0.5% 僅顯示出輕微的改善，同時注射持續時間加倍。因此，當進料速度為 1% 且在 10% 乙腈下保持等度時，可獲得最佳結果。
圖 3.（A）不同進樣模式對分離性能的影響。在 10 μL 進樣體積下，比較 FT 進樣與 0.5-10% feed 速度下 FI 所得色譜圖。10 % B（暗跡線）或 20 % B（亮跡線）的等度保持設置為 3 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。
等度保留時間的優化
如上所述，FI 應與足夠的捕獲條件相結合。需要考慮的另一點是梯度開始之前的等度保持持續時間。持續時間取決于進樣量、recondition 溶劑量和 feed 速度，而 feed 速度又取決于 HPLC 泵的流速。為了減少等度保持持續時間并進而縮短分析持續時間，最好選擇最高的進料速度，同時保持所需的分離性能。當液相泵的流速為 1.5 mL/min，20 μL 進樣量下，進料速度為 1% 時，進樣時間為 1.3 分鐘。但對比圖 4 中 2-4 min 的等度保持時間下的色譜圖，發現等度保留 2 min 時保留時間最短的化合物（峰 1）的峰不僅顯著變寬，而且相對于調整的時間軸提前 0.64 分鐘洗脫。為了揭示這種行為的原因，運行了 DCM 溶劑空白（圖 4B 中的淺色軌跡），發現 2 min 等度保持時間下，DCM 與峰 1 共洗脫，很明顯，DCM 也保留在色譜柱上，因為其峰的前沿隨著等度保持時間的增加而延遲，因此等度保持時間要足夠長，只有這樣才能將 DCM 與目標分析物分離。等度保持時間延長，梯度變化引起的基線下降與 DCM 峰前沿越來越近，這也很好說明了這一點。
圖 4. (A) 不同等度保持時間（圖中所示）對 1% 進料速度（Vinj = 20 μL）FI 分離性能的影響。此外，還顯示了 5 μL FT 進樣的 4 倍信號放大圖。每個樣品溶液色譜圖（深色）都疊加了 DCM-空白（淺色）。在 276 nm 處記錄 UV 吸收。(B) 227 nm 的波長下，并且未應用時間軸調整或放大，其他條件與 (A) 相同。
提高進樣量
當進樣速度為 1% 時，自動進樣器的進樣體積最大為 45 μL，無需手動調節 recondition 溶劑體積。圖 5 比較了 feed 進樣（45 μL）和 FT 進樣（5 μL）下的色譜圖，對于關鍵峰對（峰 3 和 4）的分辨率，FI 顯示為 1.48，而 5 μL FT 注射產生的分辨率僅為 1.18。而將 feed 進樣（45 μL）與 FT（2 μL）進樣色譜圖進行比較，在幾乎相同的分辨率下，FI 的注射量提高了 22.5 倍，也就是靈敏度可以提高 20 倍以上，這是一個實質性的改進。在該優化條件下，根據 10 ppm 樣品溶液峰高響應及噪聲來粗略地估算檢測限，檢測限（LOD）范圍在 1-10 ppb 之間。
圖 5. 1% feed 速度下 FI 最大進樣量（Vinj = 45 μL）和 FT 進樣（Vinj = 5 μL）的色譜圖的比較。10% 乙腈等度保持 2 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。
在本研究中，作者通過 RPLC 和 UV 檢測實現了 DCM 中雙酚 A（BPA）和雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的大體積進樣和分離。最初，經典流通式進樣模式下，只有注射量為 2 μL 時才有可能獲得合適的峰形和分辨率，而通過 hybrid multisampler 中新的 FI 的進樣模式，既克服了強溶劑效應，還可繼續增大進樣量，從而極大提升了方法靈敏度。總體而言，FI 在受“強溶劑效應”影響的各種應用中具有很高的痕量分析潛力。
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