本文要點：使用短波紅外（SWIR）（1000-2000 nm）分子染料進行體內生物成像相比于可見光和近紅外-I（NIR-I，700-900 nm）染料，能夠實現更深的穿透和更高的對比度。開發新的SWIR分子仍然相當具有挑戰性。本研究開發了SRHCYs，一組基于半花菁的熒光染料，其吸收（830-1144 nm）和發射（886-1217 nm）波長可調。通過增強供體部分和延長多亞甲基鏈，這些染料的光物理屬性得到了精確調整。SRHCY-3，具有可點擊的疊氮基團，被選用于活體小鼠血管的高性能成像，實現了腦和肺癌的精確檢測。這些探針的組合實現了體內多色成像，幾乎沒有光學串擾。該報告展示了一系列具有良好光譜特性的SWIR半花菁染料，用于高對比度生物成像和多重檢測。

活體成像

在這項研究中，通過分子工程設計、合成和評估了一系列名為SRHCYs的新型半菁染料，在 SWIR 窗口中具有可調的吸光度 （830-1144 nm） 和發射 （886-1217 nm） 光譜。應用供體增強和聚甲辛鏈延伸兩種策略來實現分子光學性質的高效調控，并建立了結構-光物理關系。此外，在對小鼠血液/腫瘤血管和淋巴管系統進行 SWIR 成像后，優化的體內循環速率能夠在活體小鼠中進行癌癥成像。SRHCY還具有集成可調諧 SWIR 吸收和發射特性的優勢，因此可以選擇適用的熒光團來匹配可用于體內SWIR多色成像的可用激光器和濾光片組。

在NIR-I 研究領域中，通過在堿存在下加熱氯取代花青染料（如 IR-783）的溶液來生成半菁染料。將花青染料 FD-1080 轉化生產 SWIR 半菁染料。通過增強供體并延長聚甲辛鏈以紅移吸收/發射波長，并引入了疊氮基團來功能化探針。

圖1. SRHCY 探針的設計概念

作者測試了探針的光物理性質。如圖2b、d所示，SRHCY1-4在CH2Cl2中的吸收/發射波長分別為830/886、928/1002、1036/1103和1144/1217 nm。在醛末端的二甲基氨基反應后，成功產生了典型的“推拉”結構，通過增加共軛雙鍵的數量，有效地減少了占據分子軌道未占據分子軌道能隙，從而將吸收和發射轉移到SWIR窗口（圖2c）。當共軛鏈增加一個共軛雙鍵時，在吸收和發射波長上都觀察到約100nm的紅移。延伸共軛雙鍵的策略也可以在另一個花青分子的聚乙炔家族中實現約100nm的紅移，這表明調節共軛雙鍵的數量對于含聚乙炔分子的波長調節是非常有效的。由于染料的多樣性，能夠以平衡的SWIR波長和亮度篩選分子，SRHCY-3被選為體內生物成像。

圖3. Balb/c 裸鼠背部全身血管的體內實時成像

對于體內應用，通過將PEG鏈摻入SRHCY-3中，以獲得水溶性染料SRHCY-3-PEG2000（Em=1080 nm，QY=0.04%）。與SRHCY-3（Em=1103 nm）相比，SRHCY-3-PEG2000（Em=1080 nm）的發射波長藍移了23 nm，表明聚乙二醇化對分子核心的波長影響最小如圖3所示，在靜脈注射后，對麻醉的Balb/c裸小鼠進行了曝光時間（ET）為500 ms的視頻速率成像，捕捉了背側、側面和腹側視圖。所有圖像都顯示了高空間分辨率、低背景和清晰的血管，這歸因于1300 nm以上組織吸收、散射和自發熒光的減少。肺部是顯現的器官，其次是腎臟，它們在10秒內被清晰地分辨出來，并在逐漸消退之前達到熒光強度。可實時檢測整個身體的高密度血管網絡并具有高信噪比，精確地描述了探針在小鼠血液中移動時的行為。SRHCY-3-PEG2000能夠有效地穿透小鼠腹部的皮膚，并在注射后不久在腹側視圖中清楚地描繪出小腸和結腸部分，證明了SRHCY-3-PEG2000的高性能SWIR體內成像能力。藍色虛線上的熒光強度分布顯示，染料突出顯示的血管非常清晰，由于SWIR激發和明亮的SWIR發射，峰之間明顯不同。還計算了圖像中峰值的半峰全寬（FWHM）（圖3d-f）。血管結構的準確可視化對于實時跟蹤血液循環系統至關重要，SRHCY化合物的高性能SWIR成像結果可能為未來探索血管功能障礙開辟新的可能性。

圖4. 使用SRHCY-3-PEG2000膠束（100μL，5mg/kg，根據染料濃度計算）在攜帶A549的腫瘤小鼠中腫瘤血管的代表性時間過程圖像

將SRHCY-3-PEG2000加載到膠束上（Em = 1079 nm，QY = 0.28%），是使 SWIR 分子水溶性并提高其亮度。如圖4a所示，收集1300 nm 以上的高對比度腫瘤血管圖像，研究尾靜脈注射后腫瘤血管內分子循環的整個過程。首先觀察到腫瘤的主要血管及其無序的傳入血管分支。然后，致密的毛細血管變得清晰可見，而較大血管的熒光信號減弱甚至消失。證實了SRHCY-3-PEG2000膠束的高度豐富和精細的腫瘤血管成像能力。然后，還計算主要血管和毛細血管的 FWHM 值，并在圖4 b/c 中標記。這些觀察結果表明，納米級SRHCY-3-PEG2000膠束可以為檢測 SWIR 窗口中的微觀細節提供顯著的對比度。同時SRHCY-3-PEG2000的成像遠遠超過ICG（使用ICG幾乎看不到毛細血管）。定量 SNR 分析表明SRHCY-3-PEG2000具有更高的 SNR 值。所有數據都證明了作者新設計的分子具有的光學特性。

圖5. 將SRHCY-3-PEG2000（約10μL，5 mM）注入兩只后足墊，對正常Balb/c裸鼠進行淋巴結的背側SWIR熒光成像，曝光時間為 500 ms

為了進一步驗證高亮度成像劑在生物醫學應用中的優勢，在裸鼠身上進行了淋巴管和淋巴結的成像。如圖5a所示，在俯臥裸小鼠中，將熒光團皮下注射到兩個腳墊中后，左/右腘LN和左/右骶LN被超高清標記。SRHCY-3-PEG2000也在尾部底部附近皮內注射，如圖5c所示。注射后，高信噪比染料清晰地顯示了仰臥位小鼠的淋巴管和淋巴結（圖5b），這主要證明了染料在臨床上尋找LN的潛在用途。臨床試驗使用ICG作為示蹤劑，尋找外科切除和預防癌癥轉移的前哨LN。（59）臨床醫生實際上在腫瘤附近注射ICG，以觀察引流腫瘤的淋巴管以及前哨淋巴結。將SRHCY-3-PEG5000或ICG皮內注射到攜帶A549腫瘤小鼠尾部附近。如圖5d和S24-S25所示，注射后不久，SRHCY-3-PEG5000顯示從大腿內側的淋巴結內淋巴管引流到腹股溝LN，腹股溝LN可以逐漸顯現。大約1小時后，腹股溝淋巴結和腫瘤之間的淋巴管變得明顯。然而，12小時后，淋巴管可能由于肝臟攝取信號重疊而消失。同時，從注射后6-24小時開始，腫瘤熒光從部分明亮轉變為明亮，腫瘤與肌肉的比率（TMR）增加到約3.2。至于ICG（圖5e和S26–S27），淋巴管和腹股溝LN有明顯的標記，但觀察到的腫瘤熒光信號很小。此外，非常高的信號集中在肝臟和腸道，這與之前文獻中報道的ICG的已知肝臟清除率和低腫瘤攝取率是一致的。收集淋巴管系統的橫截面強度分布顯示，SRHCY-3-PEG5000的淋巴特征明顯更清晰（半峰全寬約為441μm），與ICG在1200 nm LP濾光片下分析給定血管時觀察到的更彌漫的特征（半峰寬值為713和1623μm）形成鮮明對比（圖5f）。這一結果表明，在較長波長下工作的分子，如SRHCY-3，可以比NIR-I染料獲得更高的清晰度。

最初用PEG2000修飾SRHCY-3染料以實現水溶性，之后將PEG長度從PEG2000延長到PEG5000以改善腫瘤攝取。評估了SRHCY-3-PEG2000和SRHCY-3-1PEG5000的體內代謝特征和排泄途徑。在Balb/c裸鼠腹部注射后的不同時間點記錄SWIR熒光成像。在ICR小鼠腹部注射后，以多個時間間隔捕獲SWIR熒光圖像。給藥后6小時，SRHCY-3-PEG5000的肝臟攝取量下降了37.5%，而SRHCY-3-1PEG2000僅下降了25.3%。此外，在6小時的時間過程中，SRHCY-3-PEG5000在膀胱中的相對SWIR熒光強度保持在約2的值，而SRHCY-3-1PEG2000在1小時后沒有顯示出可檢測到的膀胱攝取。在24小時和48小時收集了排泄的尿液或糞便，SWIR半定量熒光分析表明，當PEG的聚合度增加時，肝臟信號減少，膀胱信號增加。最后，通過兩種方法評估了SRHCY-3-PEG2000和SRHCY-3-1PEG5000的生物相容性：細胞毒性研究和小鼠重要器官的H&E染色。最初，細胞毒性試驗顯示，即使在高達2 mM的樣品濃度下，兩種探針在24小時的孵育期后對細胞也沒有明顯的細胞毒性作用。這表明它們具有低毒性和良好的體外細胞生物相容性。此外，包括心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟在內的各種器官的H&E病理切片表明，這些器官沒有明顯的損傷或病變。因此，探針在體內應用中是安全且生物相容的。

圖7. SRHCY-1-PEG2000（100μM）、SRHCY-2-PEG2000（10μM）和SRHCY-4膠束（10μM）描繪雙色和三色成像

如上所述，SRHCY是具有高吸收系數、分離良好的吸光度和高效SWIR發光的生物偶聯探針；這些有價值的特性活體小鼠體內探測和區分多種成分或靶點的需要（圖7a）。探索了使用探針進行多路成像的可行性。

首先，通過瘤內注射將SRHCY-1-PEG2000給予攜帶A549的腫瘤小鼠，以精確定位腫瘤部位。隨后靜脈注射SRHCY-4膠束（圖7b）。注射后，立即使用660或1064 nm激發激光結合各種LP濾光片進行SWIR雙色成像，這允許同時成像和區分腫瘤和腹部血管。如圖7d，青色通道清晰地標記了全身血管、肺、肝，甚至腹部皮膚下的腸腸系膜血管和腸壁血管，質量很高。品紅色通道僅顯示腫瘤輪廓，表明良好的光譜分離。隨后，放大腫瘤組織，發現血管包裹著腫瘤組織，血管信號與腫瘤信號明顯分離，不受任何干擾（圖7e）。評估了三個通道的光譜串擾：660 nm激光用于SRHCY-1-PEG2000通過口服給藥追蹤腸道，808 nm激光用于NRHCY-2-PEG2000追蹤LN，1064 nm激光用于MRHCY-4膠束照亮腹部血管（圖7c）。疊加后，如圖7f所示，發現這三種顏色表現出相互分離和不干涉的特性，這表明SRHCY是一種非常好的多色成像組合。

隨著SWIR成像在學術和臨床研究中繼續蓬勃發展，鑒于SWIR區域更明顯的優勢，追求更長波長將是一種日益增長的趨勢。在這項工作中，按照結構裁剪的指導方針，在SWIR窗口中描述了一系列光譜上不同的半花菁染料，并證明了增強供體和多烯鏈伸長是將D-π-a特征半花菁化合物的吸收/發射從NIR-I窗口推到SWIR窗口的有效策略。這些實際的化學經驗可以指導或應用于其他分子骨架，以發現新的高級SWIR熒光團。其中，SRHCY-3被篩選并應用于被動成像檢測的血管系統、淋巴結/血管系統、腫瘤血管生成和皮下或原位腫瘤的成像。最重要的是，SRHCY的組合為在活體小鼠中進行多色成像提供了一種可行的方法。成像參數和造影劑設計的進一步優化可能會在未來帶來更好的應用。此外，大多數長波長SWIR分子仍然受到肝臟高攝取的影響；開發可快速從體內排泄且代謝降解很少的腎透明光學試劑可能是解決這一問題的有效方法。