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豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定、轉(zhuǎn)染方法
骨骼肌細(xì)胞是人和動物體內(nèi)最大的細(xì)胞之一，它們是由成肌細(xì)胞(Myoblasts)融合而來的多核細(xì)胞，故骨骼肌的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，并需要多種細(xì)胞信號通路的參與，包括phosphatidylinositol 3-kinase，calcineurin，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)是研究細(xì)胞分化過程的有效的模型。
該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。
細(xì)胞來源于正常動物肌肉組織，通過肌動蛋白（α-actin）免疫熒光染色鑒定為陽性，細(xì)胞純度高于90%。細(xì)胞形態(tài)位梭形，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑
（1）儀器
儀器名稱 | 規(guī)格型號 | 廠家 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X | 濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司 |
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 | BC-J160S | 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司 |
熒光倒置顯微鏡 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷凍離心機(jī) | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 |
電熱恒溫震蕩水槽 | DK-2B | 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 |
（2）試劑耗材
試劑名稱 | 規(guī)格/貨號 | 廠家 |
T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶 | 430639 | Corning |
血球計(jì)數(shù)板 | Neubauer improved | Marienfeld |
24孔板專用細(xì)胞爬片 | YA0350 | Solarbio |
細(xì)胞培養(yǎng)孔板 | WHB-24 | 上海臥宏生物科技有限公司 |
胎牛血清 | 1414426 | Gibco |
骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞專用培養(yǎng)基 | Primed-iCell-018 | 賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司 |
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA） | 1734858 | Gibco |
Collagenase Ⅰ | 17018029 | Gibco |
Collagenase Ⅱ | 17101015 | Gibco |
Collagenase Ⅳ | 17104019 | Gibco |
多聚甲醛（PFA） | P1110 | Solarbio |
DAPI | C0060 | Solarbio |
Triton X-100 | T8200 | Solarbio |
山羊血清 | SL038 | Solarbio |
Myod | 18943-1-AP | Proteintech |
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | SA00013-4 | Proteintech |
Fluoromount-G熒光封片劑 | 0100-01 | SourthernBiotech |
2．豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)
1) 首先將豬頸部動脈放血致死。
2) 小心剪取后肢肌肉，剔除脂肪，筋膜，血管等，
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次，
4) 將肌肉組織剪碎，
5) 加入3倍體積的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型膠原酶4℃冰箱過夜消化，
6) 第二天，將混合液取出置于37℃水浴鍋中震蕩消化1h，
7) 過100目篩網(wǎng)，
8) 收集濾液，
9) 300g 離心5 min，
10) 重懸沉淀，鋪瓶
細(xì)胞分離培養(yǎng)：
100x 200x
原圖見文件-細(xì)胞分離培養(yǎng)
3．免疫熒光鑒定
3.1實(shí)驗(yàn)步驟
（1）細(xì)胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1mL，加入細(xì)胞0.02million個(gè)/孔。置培養(yǎng)箱2h或過夜。
（2）固定
細(xì)胞爬片后，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃過夜。
（3）破膜封閉
將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上，
玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封閉液滴于防水膜上，將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋
破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中），將玻片（有細(xì)胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上。
鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞
一抗為Myod
3.2免疫熒光鑒定結(jié)果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原圖見文件-免疫熒光
4.轉(zhuǎn)染
4.1SV40過表達(dá)慢病毒基本信息
實(shí)驗(yàn)信息表： | ||||
產(chǎn)品名稱 | SV40過表達(dá)慢病毒 | |||
載體信息 | 載體元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
攜帶熒光標(biāo)記 | GFP □ RFP□ | 抗性基因標(biāo)記 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
載體圖譜 |
| |||
載體目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黃色區(qū)域?yàn)槟康男蛄袇^(qū) | ||||
4.2轉(zhuǎn)染
（1）將細(xì)胞接種6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105 個(gè)，
（2）第二天，待細(xì)胞貼壁后，換液，
（3）加入1mLwan全培養(yǎng)基，再加20 μL SV40過表達(dá)慢病毒，
（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，
（5）12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基，
（6）當(dāng)細(xì)胞長滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。
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原圖見文件-轉(zhuǎn)染
5.篩選
5.1殺滅曲線的確定
（1）將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜，
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，
（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，
（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，
（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開始1-4d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的zui低篩選濃度。
結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為2μg/mL，作用時(shí)間為2d。
5.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞
（1）第一天，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板，孵育過夜
（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，
（3）加入含嘌呤霉素（2μg/mL）的篩選培養(yǎng)基，孵育，
（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，
（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例，
（6）在同一時(shí)間點(diǎn)（2d）存活的細(xì)胞，即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，
（7）對篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。
6.細(xì)胞擴(kuò)增
將篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，篩選后的細(xì)胞為P1代，擴(kuò)增至少到12代。
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