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技術課堂 | 部署原位拉曼光譜實現(xiàn)生物過程的可視化
“生物過程是發(fā)現(xiàn)和制備藥物、特殊化學品、大宗能源及化學品的重要手段。先進的檢測及控制技術的缺乏極大限制了發(fā)酵過程的產率及產能，也對于發(fā)酵產物的質量有重要影響。原位拉曼光譜技術是一種可靠的PAT方法，可實現(xiàn)對于發(fā)酵過程中營養(yǎng)物、代謝物和產物以及細胞生長參數(shù)等指標的在線檢測。在線過程分析技術帶來的豐富數(shù)據(jù)可以進一步提升發(fā)酵過程工藝水平，并最終實現(xiàn)QbD（質量源于設計）。”
細胞培養(yǎng)是培養(yǎng)細胞獲取重組蛋白、抗體等生物大分子生產中的過程，這一過程直接影響到產品的產量及質量。由于細胞培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)策略會直接影響細胞的生長狀況，為保證細胞正常生長、提高產量及保證產品質量，必須監(jiān)控細胞培養(yǎng)過程。
目前，一般只對發(fā)酵過程的工藝參數(shù)，如pH、溫度、溶氧(DO)、攪拌速度等進行在線檢測和控制，而與產品質量密切相關的生化指標仍采用取樣分析方式。傳統(tǒng)的離線取樣存在取樣時間間隔較長、分析繁瑣等問題，難以滿足細胞生長的實時監(jiān)測與分析要求，因此亟需開發(fā)發(fā)酵過程中生化指標的離線快速檢測或在線檢測方法。
圖1 發(fā)酵過程及關鍵工藝參數(shù)和相關技術指標的檢測
PAT技術加速生物過程工藝開發(fā)和優(yōu)化
過程分析技術（PAT）是美國食品和藥物管理局（FDA）與歐洲藥品管理局（EMA）倡導的制藥行業(yè)工藝研究與生產的技術。PAT的本質是通過實時測量原料、過程中物料以及過程本身的關鍵技術指標來實現(xiàn)生產過程的設計、分析和控制。實施PAT能夠簡化分析過程，為生物制造過程提供連續(xù)的工作流程，并為提前發(fā)現(xiàn)和解決問題創(chuàng)造可能性。
在線光譜技術是一種現(xiàn)實可行的PAT策略，可以實現(xiàn)實時過程展示，在線參數(shù)監(jiān)測以及過程反饋控制。常見的在線光譜分析方法包括在線近紅外 (near-infrared，NIR)、在線中紅外(mid-infrared，MIR)、在線拉曼（Raman）光譜等。
圖2 梅特勒托利多在線光譜儀： ReactIR™ FTIR（傅里葉變換）光譜儀和ReactRaman™原位拉曼光譜儀
水是細胞培養(yǎng)液的主要成分，在近紅外光譜和中紅外光譜中吸收較強，培養(yǎng)液中其他成分的紅外光譜信息很容易被水的吸收峰掩蓋。而水的拉曼信號較弱，相比于紅外光譜，拉曼光譜更適合于水體系的分析，其能提供更高特異性的分子指紋信息。因此，拉曼光譜更適合用于生物過程的分析和應用。
拉曼光譜技術可原位同步分析發(fā)酵過程中營養(yǎng)物、代謝物和產物的組分濃度變化，借助化學計量學數(shù)學模型，甚至可實現(xiàn)同步監(jiān)測活細胞密度（VCD）、總細胞密度（TCD）、細胞活率（VIB）等生化指標，實現(xiàn)生物過程的實時在線過程監(jiān)測。
圖3 拉曼光譜技術可實現(xiàn)發(fā)酵過程的原位在線監(jiān)控
ReactRaman™ 原位拉曼光譜儀可以在幾秒鐘內收集和分析光譜，實現(xiàn)對生物過程的密切監(jiān)控。在定量模型的基礎上，研究人員可以對多參數(shù)進行快速和同時檢測；甚至在整合入生物反應器后，完成某一關鍵參數(shù)或物料流加的反饋控制循環(huán)。
基于所關注參數(shù)的定量模型，只需根據(jù)時刻點的光譜數(shù)據(jù)即可獲取該時刻下對應的所關注指標的數(shù)值。相比于傳統(tǒng)的離線分析方法，拉曼光譜法可以大大縮短分析時間，這對于研發(fā)人員和分析儀器資源的優(yōu)化具有重要意義。很少的取樣量（低至1ml）即可完成對于多種參數(shù)的同時快速檢測。
圖4 使用ReactRaman™原位拉曼光譜儀建立的細胞培養(yǎng)過程葡萄糖濃度和活細胞密度的過程趨勢圖
發(fā)酵體系的原位監(jiān)測日益成為行業(yè)關注的方向。生物反應器廣泛用于整個生物制藥行業(yè)，例如單克隆抗體的制造。在發(fā)酵過程中細胞代謝水平可能隨時發(fā)生波動，代謝物水平可能會明顯改變，取樣分析帶來的滯后性會錯過這些過程的表征。
ReactRaman™ 802原位拉曼光譜儀可輕松與生物反應器整合。只需將探頭插入反應器中，在高溫蒸汽滅菌之后，即可對發(fā)酵過程進行全過程連續(xù)監(jiān)測。從過往研究與實際項目經驗來看，葡萄糖濃度、乳酸濃度、谷氨酸濃度、谷氨酰胺濃度、乳酸脫氫酶濃度，活細胞密度(VCD)、總細胞密度(TCD)、細胞活率(VIB)等多個指標參數(shù)的在線監(jiān)測均可通過這種方法實現(xiàn)。
對于全過程的連續(xù)監(jiān)測提供了豐富的信息，遠遠大于取樣分析的數(shù)據(jù)量有助于提升我們對于發(fā)酵過程這一“暗室”的充分“可視化”，提升整個工藝的自動化和數(shù)字化水平。理論上，ReactRaman™ 802原位拉曼光譜儀可以幫助避免發(fā)酵過程的任何異常情況，確保生物反應器始終處于最優(yōu)的操作條件。工作人員借助實時數(shù)據(jù)可做出快速決策，從而實現(xiàn)更高的產率和產品質量。
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