線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)的應用及使用方法！

一、背景

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)是利用JC-1探針檢測線粒體膜電位變化的試劑盒，可以快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，可以用于早期的細胞凋亡檢測。

本試劑盒染料JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential）△Ψm的理想熒光探針。與其他的陽離子染料如DiOC6(3)和羅丹明123相比，特異性更高，對線粒體膜電位變化的特異性高于質膜電位變化，對線粒體去極化檢測的檢測一致性更好；紅綠色熒光強度比率只受線粒體膜電位的變化，不受線粒體大小，形狀，密度的差異干擾；檢測靈敏度強，對細胞應激反應的微小異質性都能辨別。

JC-1有單體和聚合體兩種形式，兩者的發射光譜不同。JC-1單體(J-monomer)的激發波長為514nm，發射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的激發波長為585nm，發射波長為590nm。

JC-1可以透過細胞質膜進入細胞，以單體狀態游離于胞質內，正常健康細胞的線粒體的膜電位較高，具有極性，JC-1依賴于膜電位的極性被迅速攝入線粒體的基質內，并因濃度增高而在線粒體內形成多聚體，多聚體488nm激發時的發射波長為590nm，發射光為橙紅色熒光，在流式圖上表現為FL1和FL2雙陽性；當細胞發生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，線粒體膜電位較低，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，從線粒體內釋放到細胞質，此時JC-1為單體，488nm激發時發射波長為527nm，可以產生綠色熒光，形成流式圖中細胞FL1為陽性。凋亡細胞則大多為FL1單陽性。

這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

二、使用方法

1、收集樣本細胞以及陰性、陽性對照細胞。細胞數量在2-5X105個。

2、用PBS洗滌細胞兩次。離心收集細胞。

3、用500ul JC-1染色工作液將細胞重懸，37℃，5%CO2的培養箱中孵育15-30分鐘。

4、在4°C，300-500×g力離心間5分鐘，棄培養基，收集細胞。

5、用冷PBS洗滌細胞兩次。

6、用500ul PBS將細胞重懸。

7、用流式細胞儀或熒光分光光度計檢測分析結果，或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

三、應用

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)可以用于精子線粒體膜電位檢測在評估男性生育力中的作用研究：

探索育齡男性精子線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)與精液質量、血清性激素、促性腺激素的關系及其在評估男性生育力中的作用。

方法：募集2017年6月-2020年11月至就診的男性志愿者及其配偶共90例,收集基本資料,進行精液常規分析,檢測精子MMP、精子頂體反應率(acrosomal reaction,AR)、血清性激素(T、E2)、促性腺激素(LH、FSH、PRL)、生育力指數(fertility index,FI)。分析募集者精子MMP與上述其他各指標之間的關系;計算本組募集者精子MMP截斷值并根據截斷值分為高精子MMP組和低精子MMP組,同時分析比較兩組在本研究觀察期內募集者配偶的懷孕率;根據精子濃度、精子前向運動率(progressive motility,PR)及正常形態率是否低于參考下限值,將男性志愿者分為正常組和異常組,分析上述各指標的組間差異。

結果：(1)異常組與正常組一般特征及精液參數對比:一般特征具有可比性,兩組男性志愿者配偶隨訪期內懷孕人數和兩組既往配偶有生育史人數無顯著性差異(p>0.05);精液量、p H、畸形精子指數(the teratozoospermia index,TZI)、精子尾部缺陷率、血清性激素及促性腺激素、精子AR無顯著性差異(p>0.05)。異常組精子畸形指數(the sperm deformity index,SDI)、精子頭部及頸部缺陷率較正常組高(p<0.05),精子MMP和FI較正常組明顯降低(p<0.05)。

(2)精子MMP與各指標相關分析:精子MMP與FSH(r=-0.258,p<0.05)及精子頭部畸形率(r=-0.254,p<0.05)呈負相關,與精子濃度(r=0.285,p<0.05)、精子正常形態率(r=0.319,p<0.05)、精子PR(r=0.504,p<0.05)、精子總活力(PR+NP(non-progressivity motility,NP))(r=0.463,p<0.05)、FI(r=0.443,p<0.05)呈正相關。與年齡、血清激素、LH、PRL、SDI、TZI及精子AR無統計學相關性(p>0.05)。

(3)精子MMP對精子質量正常與否的ROC曲線分析:精子MMP曲線下面積(AUC)為0.814(p<0.05,95%CI:0.725-0.903),Cut-off值為0.507,敏感性0.73,特異性0.87。

(4)高精子MMP組和低精子MMP組募集者配偶懷孕率的對比:精子MMP>50.7%組男性志愿者配偶隨訪期內懷孕人數明顯高于精子MMP≤50.7%組(χ2=5.035,p=0.025),兩組既往配偶有生育史人數無顯著性差異(p>0.05)。

結論：精子MMP是反應精子功能、精確評價精子質量及男性生育力的潛在指標,提示臨床中在精子常規參數的基礎上結合精子MMP能更精確全面地評價育齡男性的生育力。

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