ELISA試劑盒常用的方法
 

　　ELISA是Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay的簡(jiǎn)稱，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，是研究蛋白抗體的重要方法。它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶進(jìn)行直接或間接結(jié)合，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進(jìn)行定性和定量分析。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了該方法用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。我們一起聊聊常見的商業(yè)化ELISA試劑盒的方法種類以及它們各自的優(yōu)勢(shì)和用途：

　　睿創(chuàng)生物ELISA大致分為五種類型：直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法、捕獲包被法。在商品化試劑盒中用得比較多的是雙抗體夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法和間接法。

　　雙抗體夾心法是夾心法中的一種主要形式，我們先談?wù)剨A心法吧：

　　夾心法(Sandwich ELISA)分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法：

　　雙抗體夾心法中抗原的2個(gè)不同的抗原表位被兩個(gè)抗體-捕捉抗體和檢測(cè)抗體，分別結(jié)合。捕捉抗體固定于載體即酶標(biāo)板上，檢測(cè)抗體通過結(jié)合抗原進(jìn)行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測(cè)的捕捉抗體通常是單抗，偶爾有用多抗做為捕捉抗體的情況，但很少見，因?yàn)橐远嗫棺鳛椴蹲娇贵w容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)而降低特異性。檢測(cè)抗體通常為多抗，在商業(yè)化的科研試劑盒中經(jīng)常用到生物素標(biāo)記的山羊多抗，再讓生物素標(biāo)記的多抗與HRP標(biāo)記的親和素或者鏈霉親和素結(jié)合，然后再加HRP也就是辣根過氧化物酶的底物，通常是TMB反應(yīng)顯色，這種方法是在傳統(tǒng)的HRP酶標(biāo)記抗體的雙抗體夾心法ELISA中引入了生物素-親和素放大系統(tǒng)。

　　不過也有用單抗做檢測(cè)抗體的情況，尤其是在科研中。雙抗體夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢(shì)，但該法只適用于有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗原檢測(cè)，主要用于檢測(cè)各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測(cè)中測(cè)定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相關(guān)的，以及在科研中檢測(cè)細(xì)胞因子等。由于雙抗體夾心法特異性高，在檢測(cè)過程中有時(shí)會(huì)將樣本和酶標(biāo)抗體同時(shí)加入進(jìn)行反應(yīng)，稱為雙抗體夾心一步法，因?yàn)椴僮鲿r(shí)間短，在商業(yè)化生產(chǎn)中有很大優(yōu)勢(shì)。但雙抗體夾心一步法要特別注意ELISA中的鉤狀效應(yīng)(hook ffect)，因?yàn)榇藭r(shí)如果樣本中抗原含量過高會(huì)導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而無(wú)法形成“夾心復(fù)合物”，此時(shí)測(cè)出的結(jié)果將低于實(shí)際含量甚至是陰性結(jié)果。因此，如果使用雙抗體夾心一步法測(cè)定樣本中抗原含量時(shí)要注意測(cè)量的線性范圍，另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。

　　雙抗原夾心法中抗原被包被于固相，檢測(cè)樣本中的抗體結(jié)合于抗原后，使用酶標(biāo)的抗原進(jìn)行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng)，可以用來測(cè)定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上測(cè)定抗HBsAg抗體采用的就是此法，檢測(cè)時(shí)被測(cè)樣本不需要稀釋即可直接進(jìn)行測(cè)定，故此靈敏度相對(duì)而言高于我們隨后要說的間接法。

　　競(jìng)爭(zhēng)法也是一種很常用的方法，一起看看：

　　競(jìng)爭(zhēng)法(Competitive ELISA)是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體(或抗原)濃度越高，則能與固定抗原(或抗體)結(jié)合的酶標(biāo)抗體(或抗原)就越少，后續(xù)顯色就越淺，即與對(duì)照相比，顯色越淺，表示檢測(cè)樣本中抗體(或抗原)含量越高。該法特別適合小分子物質(zhì)的檢測(cè)也可用于檢測(cè)比較不純的樣本，且重復(fù)性好，但是檢測(cè)的靈敏度和專一性較差。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原常用于檢測(cè)小分子抗原及半抗原，這類抗原通常缺乏兩個(gè)以上的識(shí)別位點(diǎn)，不適用于雙抗夾心法進(jìn)行測(cè)定。該方法在商業(yè)化ELISA試劑盒中被廣泛運(yùn)用。

　　最-后再說說間接法，間接法(Indirect ELISA)只能用于測(cè)定抗體，主要用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)是只需要改變包被抗原，酶標(biāo)抗體是通用的。間接法使用了二抗增加信號(hào)強(qiáng)度，也使抗體的選擇多樣化，然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

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