植物RNA提取試劑盒的操作步驟與應用！

一、背景

植物RNA提取試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質總RNA，也適用于真菌菌絲RNA的提取。的Shredder分離柱，用于勻質化和過濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時采用硅基質膜吸附RNA進行純化，使多聚糖等各種污染物通過洗滌被有效去除，經洗脫的RNA可直接用于各種下游實驗。由本試劑盒提取RNA分子量大于200堿基，純度高，幾乎無DNA殘留。如果是對微量DNA非常敏感的RNA實驗，殘留的DNA可利用無RNase的DNase在柱上進行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot、RT-PCR和體外翻譯等實驗。

二、操作步驟

1、50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇)或Buffer RLC。渦旋振蕩使其充分裂解。

2、將步驟1所得全部液體轉移至已裝入收集管的過濾柱中，12000rpm(~～13400×g)離心2分鐘，將收集管中的上清液轉移到一個新的離心管(自備)中。

3、在步驟2所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無水乙醇，迅速混勻。

注意：加入乙醇后可能會產生沉淀，但不影響后續試驗。

4、將上步得到的溶液轉移到已裝入收集管的吸附柱中,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉入;12000rpm離心15秒，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

5、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混勻，配制成終體積為80μl的反應液。

7、向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘。

8、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇),12000rpm離心15秒,棄廢液。

10、重復步驟9。

11、將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心1分鐘，將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干吸附柱中的無水乙醇。

12、將吸附柱裝入新的離心管中，向吸附膜的中間加入30-50μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

三、應用

用于馬鈴薯病毒快速檢測技術的建立與應用研究：

馬鈴薯病毒病是重要的馬鈴薯病害，每年均造成嚴重的經濟損失。目前，生產和利用脫毒種薯是防治馬鈴薯病毒病的重要方法，快速、準確的馬鈴薯病毒檢測技術是保證脫毒種薯質量的關鍵。

研究依據馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯A病毒（PVA）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因序列設計合成了4對具毒特異性的引物。利用病毒特異性引物，以帶有不同病毒的馬鈴薯樣本總RNA為模板分別進行RT-PCR擴增，獲得了4條DNA片段，將4條DNA片段與克隆載體連接后轉入大腸桿菌進行序列測定，對測序結果進行分析證明PCR擴增所得DNA片段確為目標病毒相應的目的基因片段（核苷酸同源性達到99%以上）。

利用4對病毒特異性引物建立了4種病毒的常規RT-PCR檢測技術。對馬鈴薯病毒RT-PCR檢測技術中RNA的提取方法進行了改進，以解決由于馬鈴薯塊莖淀粉含量過高而導致利用常規的植物RNA提取試劑盒無法提出塊莖RNA的問題。首先研究開發出一套新的馬鈴薯塊莖總RNA提取方法，利用此方法制備的RNA*符合后續進行馬鈴薯病毒RT-PCR檢測的要求，而該方法更為快速、簡便，且成本低廉，適用于大量樣品的提取檢測。

在此基礎上，又研制開發了一種新型緩沖溶液，在進行病毒檢測時，將馬鈴薯塊莖組織在此緩沖溶液中研磨勻漿后，即可直接進行RT-PCR檢測，不需進行馬鈴薯塊莖RNA的提取，因此，該方法操作更加簡便，檢測效率更高，成本更低。該方法在國內尚未見報道。

對馬鈴薯病毒RT-PCR檢測技術的反應體系及反應程序進行了改進。利用PVS、PVY、PVA的特異性引物建立了可對3種病毒進行同步檢測的三重RT-PCR檢測技術，并對PCR反應中的MgCl2的濃度進行優化，結果表明，當MgCl2濃度為5.5mmol/L時，PCR檢測。

此方法更為快速、簡便、高效。采用所建立的病毒檢測技術對河南省和黑龍江省部分脫毒試管苗和脫毒種薯進行了檢測，結果表明，河南省的樣本中檢出率的為PVY，其次是PVA；黑龍江省的樣本中檢出率的是PVS、其次是PLRV。采用所建立的病毒檢測技術對我國部分馬鈴薯產區中馬鈴薯病毒病發生情況進行了調查。