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杭州實了個驗生物科技有限公司
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瀏覽次數賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀操作規程
以下是 賽默飛 QuantStudio Q5 實時熒光定量PCR儀 的標準操作規程（SOP）。此規程涵蓋實驗前準備、儀器操作、實驗設置、運行和數據分析的步驟。
1. 實驗前準備
1.1 儀器檢查
確保儀器接通電源并處于正常工作狀態。
打開 QuantStudio Q5 儀器和配套的軟件系統。
檢查儀器光學模塊是否清潔，無塵無污染。
確認實驗室環境穩定（溫度20-25°C，濕度40-60%），避免灰塵干擾。
1.2 反應材料準備
準備 PCR 反應所需試劑和耗材：
樣本模板（DNA 或 RNA 轉錄的 cDNA）。
引物和探針（根據靶標基因設計）。
熒光定量PCR試劑（如SYBR Green Master Mix或TaqMan Master Mix）。
96 孔板或 0.2 mL PCR 管，以及光學透明封板或封膜。
無菌移液器、濾芯吸頭。
1.3 標準反應體系
以下是 20 µL 體系的標準配方示例：
| 成分 | 體積（µL） | 說明 |
|---|---|---|
| PCR Master Mix | 10 | 含有聚合酶、dNTP、Mg2?等 |
| 上下游引物（10 µM） | 0.5 各 | 根據靶基因調整濃度 |
| 探針（10 µM）或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探針或 SYBR Green |
| 模板 DNA/cDNA | 1-2 | 根據樣本濃度調整體積 |
| 無核酸酶水 | 至 20 µL | 補足總反應體系體積 |
1.4 注意事項
反應體系混合時保持在冰上操作。
混勻后輕微離心，避免產生氣泡。
使用負對照（無模板對照）和正對照，確保實驗的可靠性。
2. 儀器操作步驟
2.1 啟動儀器
打開 QuantStudio Q5 實時熒光定量PCR儀。
啟動配套軟件（QuantStudio Design and Analysis Software）。
選擇“新建實驗"以創建實驗文件。
2.2 實驗參數設置
實驗類型選擇：
絕對定量：用于計算 DNA 或 RNA 的絕對拷貝數。
相對定量：用于基因表達水平比較。
溶解曲線分析：檢查 PCR 產物的特異性。
基因分型：分析基因突變和 SNP。
板型設置：
根據實驗需求選擇 96 孔或 384 孔板格式。
為每個孔輸入樣本名稱（如標準品、未知樣本、對照組）。
熒光染料設置：
根據使用的染料或探針設置相應的熒光通道（如 FAM、VIC、ROX）。
啟用 ROX 參考染料（如果試劑中包含）。
熱循環程序：
初始變性：95°C，2-10 分鐘。
循環反應（40 次循環）：
95°C，15 秒（變性）。
60°C，30-60 秒（退火和延伸，熒光信號采集階段）。
設置標準 PCR 循環程序：
如果需要溶解曲線分析，加入升溫梯度（如從 60°C 至 95°C）。
2.3 加載樣本板
將已封裝好的 PCR 板或管放入樣本托盤。
確保 PCR 板放置平穩，并封膜牢固，避免蒸發。
關閉樣本艙門，確保儀器密封。
2.4 啟動實驗
檢查設置無誤后，點擊 “運行實驗"。
儀器開始運行，同時采集熒光信號。
在運行過程中，實時監測擴增曲線以確認擴增反應正常。
3. 數據分析
3.1 實時監控
儀器運行時，軟件界面會顯示擴增曲線的實時變化。
檢查所有樣本的熒光信號是否正常累積。
3.2 Ct 值分析
Ct 值（循環閾值）： 自動計算每個樣本的 Ct 值，Ct 值越低，樣本初始濃度越高。
對照標準品生成標準曲線，用于絕對定量計算樣本濃度。
3.3 溶解曲線分析（SYBR Green 實驗）
檢查 PCR 產物是否特異性擴增。
特異性擴增應顯示單一峰值，非特異性產物會有多個峰值。
3.4 數據導出
將分析結果（擴增曲線、Ct 值表、溶解曲線等）保存為 Excel、PDF 或圖片格式。
確保實驗數據備份并存檔。
4. 實驗完成后的維護
4.1 清潔儀器
實驗完成后，取出樣本板并清理托盤。
用無塵布輕輕擦拭儀器內部，防止樣本殘留。
4.2 光學模塊維護
定期清潔光學模塊，保持熒光檢測的靈敏度。
如果出現熒光信號異常，需校準光學模塊。
4.3 溫控校準
按照儀器使用手冊，每 3-6 個月對溫控模塊進行校準，確保溫度一致性。
4.4 軟件更新
定期檢查軟件版本，安裝賽默飛發布的最新補丁或更新。
5. 注意事項
樣本操作
使用無核酸酶污染的耗材和移液器。
避免模板 DNA 交叉污染。
試劑保存
熒光染料和酶類應按照試劑說明存放（如 -20°C 冷凍）。
使用前確保試劑混勻。
實驗運行
在運行過程中不要隨意中斷儀器運行，防止數據丟失。
若出現異常終止，記錄故障代碼并聯系賽默飛技術支持。
總結
賽默飛 QuantStudio Q5 熒光定量PCR儀以其靈活性和高精度著稱，是中小型實驗室開展基因定量分析的理想工具。嚴格按照操作規程（SOP）進行實驗，可提高實驗結果的可靠性和可重復性，同時確保儀器的長期穩定運行。
