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His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)

His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）

產品貨號：26421（5ml）

產品簡介：

His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）包含Ni-Agarose填料、親和柱空柱以及可溶性His融合蛋白純化所需的全部試劑（細菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、結合緩沖液和洗脫緩沖液組分），使用方便。該鎳柱純化系統對6×His-tag蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有6個組氨酸親和標簽的蛋白。該系統具有4個Ni²⁺螯合位點，較只有3個螯合位點的Ni-IDA結合Ni²⁺ 更為牢固，有效防止純化過程中Ni²⁺脫落且增強對His標簽蛋白的結合能力，提高純化效率。較高的基團密度，大大提高了蛋白載量。該系統在天然或變性條件下，對來源于各種表達系統（如桿狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌）中的His標簽蛋白，均有很好的純化效果。本產品已螯合鎳離子，可直接用可溶性蛋白的純化，使用方便，快捷。

支持物： CL-6B瓊脂糖凝膠

載量： 20-30 mg His標簽蛋白/ml填料

粒徑： 50-160 µm

產品內容：

操作步驟：

Ⅰ緩沖液的準備    

可溶性蛋白純化緩沖液配方：

Ⅱ組裝層析柱

1. 將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后， 把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。

注意：

1）填料的上層是乙醇保護層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mg His標簽蛋 白計算，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。

3）本實驗都是通過重力作用使溶液流出。

2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子，平衡結束后即可上樣。

注意：柱體積指的是填料的體積。

Ⅲ可溶性蛋白的純化

1. 收集菌體后，每100 mg菌體（濕重）加入1-5 ml細菌裂解液（每1 ml 細菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），超聲裂解菌體。

注意：

1）當提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時，建議加入DNase I和Lysozyme。每1 ml 細菌抽提試劑中加入1 μl DNase I（1,000 U/ml），2 μl Lysozyme（50 mg/ml）。

2）超聲過程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實驗中自己摸索，應避免連續超聲導致的大量產熱，可分成短時間，多次超聲，通過一定的間隔時間避免溶液過熱。最終菌液變清即可。

2. 10000 rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白。

3. 用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負載上柱，流速為10倍柱體積/小時，收集流穿液。

注意：

1）本試劑盒中附帶有一塊篩板，使用時先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質較多的蛋白的過濾，防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出。

2）通過控制加入的菌體裂解液的速度來控制流速。

4. 使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。

5. 使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

  注意：洗脫峰可以分管收集，每1 ml收集1管，并采用蛋白監測儀監測，收集洗脫峰

6. 洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），封柱后2-8℃保存。

  注意：如果是分段梯度洗脫，最大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達到500 mM時，則使用濃度為500 mM的咪唑進行洗脫10倍柱體積后，再進行第6步的操作

Ⅳ柱再生

當填料使用多次后，結合效率會有所下降（表現為流速變慢或填料失去藍綠色）， 可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。

1. 使用2倍柱體積的6 M鹽酸胍沖洗后，使用3倍柱體積的去離子水沖洗。

2.  使用1倍柱體積的2% SDS沖洗。

3.  依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5倍柱體積的100%乙醇沖洗，再依次使用1倍柱體積的75%、

50%和25%的乙醇沖洗。

4. 使用1倍柱體積的去離子水沖洗。

5.  使用5倍柱體積含50 mM EDTA緩沖液（PH8.0）沖洗。

6.  使用3倍柱體積去離子水，3倍柱體積20%乙醇沖洗。

7.  2-8°C保存。

8. 再次使用前，需首先使用10倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5個柱體積的50 mM NiSO₄再生，3個柱體積的Binding Buffer平衡。

注意事項：

1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性，本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化。

2. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT和EDTA。

3. 整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。

4. 為提高純化效率，首先確定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用濃度。必要時可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，Binding Buffer的范圍為0-10 mM，洗脫緩沖液的范圍為10-500 mM來進行。并通過SDS-PAGE或Western Blotting來檢測目的蛋白的純度。

5. 請使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過0.22µm或者0.45µm過濾器過濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進行離心，或者使用0.22µm或者0.45µm過濾器過濾。

6. 柱再生時，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。