過氧化氫酶（CAT）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號：BA1107

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

H₂O₂在240nm下有特征吸收峰，CAT能夠分解H₂O₂，使反應(yīng)溶液240nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出CAT活性。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體100μL×3瓶，4℃保存。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500-1000:1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20%或200w，超聲3秒，間隔10秒。重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為1：5-10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

二、CAT測定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至240nm處，蒸餾水調(diào)零。

2、CAT檢測工作液的配制：用時(shí)在每瓶試劑二中加入20mL試劑一，充分混勻，作為工作液；用不完的試劑4℃保存一周。

3、測定前將CAT檢測工作液在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min。

4、取1mLCAT檢測工作液于1mL石英比色皿中，再加入35μL樣本，混勻5s；室溫下立即測定240nm下的初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。計(jì)算ΔA=A1-A2

三、CAT活性計(jì)算：

1、血清（漿）CAT活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=678×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V樣×Cpr）÷T=678×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=678×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(U/10⁴ cell)＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=1.356×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1.035×10^-3L；ε: H₂O₂摩爾吸光系數(shù)，4.36×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.035ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。W，樣本質(zhì)量，g；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。