Annexin V PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒

產品貨號: BA1984

產品規格: 20T/50T/100T

產品簡介：

細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS 的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用AnnexinV與7-AAD雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。

產品組成：

操作步驟（僅供參考）：

1. 細胞樣品的準備：

a) 對于貼壁細胞：小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用不含EDTA的胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清；

b) 對于懸浮細胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清；

2. 用去離子水按1:3稀釋結合緩沖液(4ml 4×結合緩沖液+12ml去離子水)；

3. 用1×結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其濃度為1-5×10⁶ /ml；

4. 取100µl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/PE混勻后于室溫避光孵育5分鐘；

5. 加入10µl 20ug/ml的7AAD，并加400µl PBS，立刻進行流式檢測。

實驗設計：

1）未轉染細胞

空白管：陰性對照組細胞，不加Annexin V/PE，7AAD，用于調節電壓。

單染管：陽性對照組細胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD，用于調節補償。

檢測管：處理的細胞，加Annexin V/PE，7AAD。用空白管和單染管調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。 2）轉染GFP

未轉染空白管：未轉染細胞，不加Annexin V/PE，7AAD，用于調節電壓。

未轉染單染管：未轉染且有明顯凋亡的細胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD，用于調節補償。

轉染GFP空白管：轉染GFP對照組細胞，不加Annexin V/PE，7AAD，用于調節補償。

檢測管：處理的細胞，加Annexin V/PE，7AAD。調節好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。

注意事項:

1. Annexin V是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而PS在不同種屬間沒差異。在正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，PS由脂膜內側翻向外側。

2. 低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞2～3次，離心機4℃1000rpm 5min離心，處理得當的話，胰酶造成損傷可以控制在5%以內，有對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響。

3. 先加PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且PI本身對細胞也是有毒性的，對實驗結果影響會比胰酶大，不建議這樣做。

4. Annexin V是Ca依賴的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca離子從而影響Annexin V，進而影響結果。

5. 用流式檢測凋亡時，7AAD受時間的影響很大，因標記了7AAD后會加大細胞毒性，隨著時間延長會導致7AAD的染色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大。一般7AAD加上后立刻上機，然后在一個小時內檢測完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成的誤差會更小。

保存條件：2-8℃避光，勿冷凍。6個月有效。