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免疫熒光標記染色探討
閱讀：164 發布時間：2023-8-1 熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質。熒光物質是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發成為激發態，當從激發態恢復基態時，發出熒光。熒光標記技術指利用熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒光標記的無放射物污染，操作簡便等優點，使得熒光標記物在許多研究領域的應用日趨廣泛。
熒光標記物質在蛋白的功能研究、藥物篩選等領域也有著廣泛的應用。人們利用利用熒光標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，并將其發展的高通量活性篩選方法應用于疾病治療靶點蛋白的藥物篩選和藥物開發（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。熒光標記是非常常用的實驗方法。一般來講，熒光標記染色的目的有3個：
1、多種蛋白標記后，分析蛋白在空間上的分布特征；
2、免疫熒光標記后進行蛋白半定量分析，分析蛋白半定量表達量；
3、標記細胞核，以便分析細胞核數量，如凋亡細胞計數等。
上方所述的第1條和第3條是熒光標記染色的最佳應用場景，一般并不推薦將熒光標記應用于第2條。如果一定要在熒光圖像上進行蛋白半定量分析呢？其實也是有一個測量標準，即測量灰度。
1、灰度的概念應用
與WB蛋白條帶分析原理一致，免疫熒光分析也是圍繞灰度進行分析。不同的熒光強度本質上可以理解成灰度值的差異，因為在分析時，我們是在同一通道下進行比較的。舉個例子，大家都是紅色的，只是紅色的強度和分布面積不同，這個強度可以灰度來代替。再細化一下灰度概念，我們測量圖像時，是為了得到積分灰度值或者平均灰度值。積分灰度值即圖像上目標區域所有像素點的灰度值之和，可以代表目標區域所包含蛋白的總相對表達量。
平均灰度值即目標區域積分灰度值除以目標區域面積，可以代表目標區域的平均蛋白表達量。
個人認為平均灰度值是更適合的測量指標，因為它有積分灰度值和面積這兩個指標的約束，相較于積分灰度值來說更靠近客觀事實。
2、通道分割
最簡dan 的免疫熒光標記是DAPI（藍）+單通道熒光（紅或綠）。如下
這種是最普通的熒光標記，圖像上只有2個通道激發光。在分析之前，必須將2個通道的熒光分割開，獲得2張圖像。其實這就是熒光圖像merge的反向操作。
無論是image J或者是Image Pro Plus軟件，都內置通道分割的功能。因此，實施起來還是很簡單的。
同理，多色熒光標記其實就是多了通道而已，分割方法也是一樣的。
3. 熒光強度轉換為灰度
無論是JPEG格式還是TIFF格式的熒光圖像，都是32bit RGB圖，但是灰度圖是8bit 黑白圖像。
因此，在進行灰度分析之前，必須對原始彩色圖像進行格式轉換，最終得到8bit 黑白圖像。常做蛋白條帶分析的人肯定清楚，分析之前，先對原始圖像去色，然后再轉換成8bit 黑白圖。熒光圖像的灰度分析，也是這么個道理。
4、測量
測量是很簡單的。原理是在一定的分割閾值下，選擇測量參數為Area、Mean gray value這兩個測量指標。
值得一提的是，分割閾值。閾值8bit 黑白圖像中很重要的一個參數，它的大小直接決定了目標區域的面積和灰度值。其功能類似于彩色圖像中的γ值。
有經驗的朋友知道，通過調整γ值可以調整整個圖像的特征；同一張圖在不同的γ值下，甚至可能變成兩個wan 全不同的圖像。
所以，在進行測量時，分割閾值是非常值得仔細斟酌的測量條件。