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小鼠elisa試劑盒醫(yī)學院研究 ：目的本文通過體內外實驗觀察氟影響下成骨細胞中刺猬蛋白（Hedgehog, Hh）信號通路分子及其下游成骨相關因子、凋亡相關因子的表達變化，討論Hh信號特異性阻斷劑環(huán)巴胺（Cyclopamine, Cycl）的阻斷效果；并檢測氟中毒大鼠骨組織中與骨髓微環(huán)境相關的細胞因子變化情況，深入探討氟影響大鼠骨骼病變時Hh信號變化與骨形成增強的關系，為氟骨癥治療靶點的研究提供實驗依據。方法1、不同濃度的含氟水飼養(yǎng)大鼠6個月，觀察氟斑牙發(fā)生情況及測定尿氟含量，明確氟中毒大鼠模型建立成功后，檢測各組大鼠骨氟含量。光鏡觀察骨組織病理形態(tài)學改變；抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）鑒定破骨細胞并計數。酶聯免疫吸附法（Enzyme-LinkedImmunosorbnent Assay, ELISA）檢測各組大鼠血清骨堿性磷酸酶（Bone alkalinephosphatase, BALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acidphosphataseform5b, TRACP5b）含量；免疫組織化學（Immunohistochemistry,IHC）觀察Hh信號分子和成骨、破骨相關因子的定位及表達情況，探討Hh信號變化與骨形成、骨吸收間的關系。2、實時熒光定量PCR（Real-timefluorescence quantitative PCR, real-time PCR）、IHC和蛋白印跡（Western Blot）檢測氟中毒大鼠骨組織Hh信號通路中主要因子的mRNA和蛋白表達情況，觀察高低劑量氟對Hh信號變化的影響。3、給予高氟組大鼠Cycl腹腔注射，觀察Cycl阻斷后大鼠氟斑牙、尿氟和骨氟含量、血清BALP含量變化情況。細胞增殖與活性檢測試劑盒（cell counting kit8, CCK8）篩選出體外培養(yǎng)成骨細胞時氟和Cycl的*藥效濃度，偶氮偶聯法（p-nitrophenyl phosphate，pNPP法）測定培養(yǎng)成骨細胞堿性磷酸酶（alkaline phhosphatase, ALP）活性。原位末端轉移酶標記法（Transferase-mediated dUTP-bintin, TUNEL）定位并計數骨組織中凋亡成骨細胞個數；流式細胞術檢測培養(yǎng)成骨細胞凋亡率。Real-timePCR、IHC和Western Blot檢測動物模型和培養(yǎng)成骨細胞中Hh信號通路主要分子、其下游成骨相關因子及凋亡相關因子mRNA和蛋白表達，進一步探討Cycl對氟暴露下培養(yǎng)的大鼠成骨細胞Hh信號的阻斷效果及對成骨細胞增生的影響。4、Real-time PCR、原位雜交（in situ hybridization, ISH）和IHC檢測氟中毒大鼠骨組織與骨髓微環(huán)境相關細胞因子的mRNA和蛋白表達，探討氟中毒大鼠骨骼損傷時Hh信號與骨髓微環(huán)境變化的聯系。結果1、慢性氟中毒大鼠氟斑牙發(fā)生率、尿氟和骨氟含量、血清BALP含量隨染氟劑量的增加而逐漸增加，提示慢性氟中毒大鼠模型建立成功。氟中毒大鼠骨組織呈骨質硬化表現。2、氟中毒組大鼠Hh信號通路因子印度刺猬蛋白（Indian hedgehog,Ihh）和音速刺猬蛋白（Sonic hedgehog, Shh）及骨形成相關因子Runt相關轉錄因子2（runt-related transcription factor2, Runx2）和成骨特異性轉錄因子（Osterix, Osx）蛋白表達隨染氟程度加重呈逐漸增強。但破骨細胞計數、血清TRACP5b、骨吸收相關因子核因子κB受體活化因子配體（receptor activatorfor nuclear factor-kappa B ligand, RANKL）和細胞核轉錄因子κB（nuclear factorkappa B, NF-κB）p50蛋白表達則在低氟組升高較高氟組明顯。氟影響下，Hh信號因子變化與骨形成間呈正相關性。3、氟中毒組大鼠骨組織中Hh信號通路的配體（Ihh、Shh）、跨膜蛋白（Smoothened，Smo）及核轉錄因子神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白1（Glioma-associated oncogene homolog, Gli1）、Gli2mRNA和蛋白表達也較對照組表達增強，呈劑量依賴性；跨膜蛋白受體（Ptched1，Ptch1）和核轉錄因子Gli3的mRNA和蛋白表達則在各組間比較無明顯差異。4、應用Cycl阻斷處理后，大鼠氟斑牙發(fā)生率、尿氟和骨氟含量與氟中毒組比較無明顯差異。氟+Cycl處理組大鼠血清BALP含量較氟中毒組降低；培養(yǎng)細胞中，經氟和Cycl處理后ALP活性亦降低。Cycl處理后的大鼠骨組織及培養(yǎng)成骨細胞中Ihh、Shh、Smo、Gli1、Gli2mRNA和蛋白表達較氟中毒組表達減弱，Hh信號通路下游的成骨相關因子Runx2和β鏈蛋白（β-catenin）表達也較氟中毒組減弱，Osx則與氟中毒組無明顯差異。5、氟中毒大鼠成骨細胞凋亡陽性率增加，但經Cycl處理后變化不明顯；流式細胞術結果顯示，2.5mg/L NaF處理組成骨細胞凋亡率較5mg/L NaF處理組升高更明顯。經氟處理后再用Cycl阻斷，細胞凋亡率較加氟處理組升高。體內外實驗證實，氟暴露可致大鼠成骨細胞中B細胞淋巴瘤-2（B-cell Lymphoma-2,Bcl-2）表達降低、Bcl-2基因相關X蛋白（Bcl-2accociated X protein, Bax）表達增強、Bcl-2/Bax比值降低。再經Cycl處理后，Bcl-2、Bax表達和Bcl-2/Bax比值與氟中毒組比較變化不大。體外實驗則顯示，與氟處理組比較，氟+Cycl處理后Bcl-2表達增強、Bax表達降低、Bcl-2/Bax比值升高。6、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）、白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和IL-6可在慢性氟中毒大鼠成骨細胞中呈陽性表達，三者的mRNA和蛋白表達隨染氟增加而增強，但IL-1β和IL-6在低氟組和高氟組間比較無明顯差異。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）在成骨細胞中未見陽性表達，在巨核細胞中呈弱陽性表達，各組間比較表達強度無明顯變化。骨氟、Ihh表達與TGF-β1、IL-1β和IL-6表達間均呈正相關性，骨氟、Ihh表達與TNFα表達間無明顯相關性。結論1、在一定劑量氟暴露下，大鼠骨形成強于骨吸收，骨組織呈骨質硬化表現。BALP可作為一個判斷氟致骨質硬化的早期生物學指標。2、氟可刺激大鼠成骨細胞Ihh表達增加，此信號經由Smo介導，激活Gli2后將信號轉錄入細胞核內，誘導Runx2表達，使成骨細胞增生、BALP活性增強，終導致大鼠骨組織出現了骨質硬化表現。與此同時，氟致Hh信號活化可經由Bcl-2介導成骨細胞凋亡，凋亡產物又可進一步刺激成骨細胞增殖過程。3、Cycl對氟致Ihh信號活化有一定抑制作用，在體外實驗中可抑制成骨細胞增生，為氟骨癥治療藥物的研究提供了實驗依據。4、Ihh信號影響骨髓微環(huán)境的Hedgehog信號在慢性氟中毒大鼠骨骼損傷中的作用機制及其與骨髓微環(huán)境變化的關系變化，在一定程度上參與到氟骨癥骨質硬化的發(fā)病機制中。