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PCR產物常用的直接純化技術方法

閱讀:77          發布時間:2025-2-14

PCR產物一般都含有過量的引物、 Taq DNA酶及dNTP,這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。PCR擴增完成后需要進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,在條帶單一無其他雜帶的情況下,可以直接對產物進行純化,常見的純化方法有:
一、產物直接純化:
1、硅膠層析柱法

原理:大多數離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜,實際上就是一層玻璃纖維,其表面有大量修飾的硅羥基(Si-OH),硅羥基在溶液中解離后帶負電,然后與帶正電鹽離子、帶負電DNA形成電橋,從而吸附住DNA,使得DNA雙鏈變單鏈,不會被生物大分子溶劑洗脫,但能經水溶性緩沖液水化后,被定量回收,從而實現純化分離。

              圖1 硅膠層析原理示意圖

2、磁珠法(abs60151
原理:磁珠是有磁性的能吸附DNA的物質,其內部核心是鐵離子,在磁場作用下可以吸附在磁體上。在核心外,經過羧化,帶有羧基基團,在特定的離子條件下,可以與DNA結合。結合后,在外磁場的作用下,磁珠與DNA結合體移動到磁體周圍,可以很方便去除其他多余的液體,這時,不能與磁珠結合的所有雜質都隨水溶液一并去除。然后,在洗脫條件下,DNA與磁珠分離,溶解在水中,將溶解有DNA的溶液轉移,就得到了純化后的DNA樣本。

                        圖2 磁珠法結構示意圖


3、其他純化方法
①滲透液結合醇沉純化
原理:利用分子大小不同,小分子的物質能夠通過滲透膜溶解到大量的溶液中去,而大分子的物質不能通過滲透膜,所以繼續留存在透析袋中,通過乙醇沉淀最后達到去除小分子物質,得到純化的有機大分子的效果。
②直接沉淀純化
原理:DNA分子在高鹽離子醇溶液中會被沉淀出來,而其他物質繼續溶液在溶液中,沉淀出來的DNA分子經過離心與溶液成分分開,達到純化的目的。
不同純化方法對比:

二、其它,凝膠回收純化:
如電泳檢測結果存在非特異性條帶,則需要將目的條帶切出來,再用膠回收試劑盒(abs60098)對凝膠進行回收純化,相較于直接純化,只是多了一步溶膠的過程,相應的產物純度提高,回收率則下降。
結語:
在PCR擴增完成后,反應體系中除了DNA片段,還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質,這些物質會影響后續克隆測序等實驗,因此對其產物進行純化是必要步驟,不同的純化手段各有自己的優缺點,可以根據自己的需求選擇適合自己的方法。

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