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原代細胞培養具體方法步驟敘述
閱讀：175 發布時間：2024-1-8一、準備工作
準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試，具體內容可參閱有關文獻。
二、取材
在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首ci 培養稱為原代培養。
理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。
三、培養
將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。
正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養進入培養后有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代"。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。
四、凍存及復蘇
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。
復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。
凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
培養具體步驟：
1.準備：取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2.布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。
3.處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。
4.剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。
5.消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
6.分離：在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液。
7.計數：用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中。對大多數細胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調整。
8.培養：置于36.5℃溫箱培養，如用CO2溫箱培養，瓶蓋需擰松半圈。