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流式干細胞實驗中熒光染料如何選擇
(1)確定熒光染料本身所適合的流式干細胞儀,需要了解染料的激發波長和發射波長、儀器所配制的檢測濾光片和激發光源。
(2)了解熒光素的相對熒光強度:相對熒光強度反映的是熒光素-單抗結合物的亮度,其判斷標準是染色指數。影響相對熒光強度的因素包括:不同儀器的激光及濾片組合不同,熒光素的相對熒光強度不同;抗體上熒光素分子的多少會影響相對的熒光強度。
(3)選擇原則:考慮抗原的密度【高密度表達的抗原可考慮選擇幾乎所有的熒光素;低密度表達的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素,如PE/APC。】;自發熒光【每種干細胞群都有不同水平的自發熒光,所有的熒光通道均可觀察的自發熒光,但自發熒光強度在波長較長時迅速降低。對自發熒光較強的細胞,選擇發射波長長的熒光素(APC)可得到較好的S/N比值,對于自發熒光強度弱的細胞,發射波長長的熒光素對S/N提高沒有明顯的改善,可選用FITC。】;非特異性結合;復合染料【避免信號衰退。復合染料因為光、固定劑或溫度升高會導致信號衰退,使復合染料在上一級染料處發光。減少樣本暴露于光、高溫或固定劑,可很大程度上避免這一問題。若樣本需要固定,要選擇穩定的固定劑,可有效阻止復合染料的信號衰退。盡量減少信號間的干擾,檢測的顏色越多,面臨的信號干擾越多,選擇試劑時盡可能降低熒光發射波長間的重疊。】。
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