中醫藥的作用機制是多層面且復雜的，涉及多種因素和機制。當前研究面臨的一大挑戰就是發現并確認中醫藥在體內作用靶點以及對應的活性組分，從而闡釋其藥效作用的分子機制，為中醫藥作用機理提供了現代科學的闡釋。鑒定小分子藥物作用的靶蛋白對于理解小分子藥物的作用機制和應用有著至關重要的作用，這不僅有助于進一步發現小分子藥物的脫靶靶標、副作用，還能深入探究靶蛋白參與的生物學功能。
長期以來，由于中藥成分的復雜性和微量化，對其靶點和分子機制的研究一直沒有取得重大進展，對檢測和分析方法的靈敏度、粗樣品和有機溶劑的耐受度要求非常高。為突破這一研究瓶頸，北京大學的屠鵬飛課題組聯合浙江工業大學顏繼忠課題組發表最新的文章[1]以參芪降糖顆粒(SJG)為例提出了一種結合傳統中藥微球和生物層干涉測量（BLI）技術的新方法，用于發現復雜基質中的關鍵藥物靶點。
參芪降糖顆粒(SJG) 是臨床上常用的治療2型糖尿病及其并發癥，如糖尿病腎病(DN)的中藥制劑。由人參、黃芪、地黃等11種草藥組成，但其干預DN的生物學靶點和機理仍不清楚。
圖1. 基于傳統中藥微球（TCM-MPs）的靶點捕釣策略：
①TCM-MPs的構建
②TCM-MPs富集特異靶點
③用Octet® 進一步垂釣相關化合物，并進行驗證
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構建TCM-MPs和靶蛋白富集
——以“粗”釣“粗”
這些微球由四層結構組成：Fe3O4磁性納米層、油酸修飾層、光親和基團（TAD）層和活性小分子層。TAD在紫外光下產生高活性的卡賓，可以非特異的固化藥物分子。研究人員構建了基于SJG的TCM-MPs被用于捕釣人腎小球系膜細胞（HMCs）裂解物中相關蛋白，利用TCM-MPs與細胞裂解液共孵育，通過UHPLC-Q/TOF-MS/MS分析篩選目標蛋白，篩選出了28個差異蛋白。基于生物信息學分析，研究人員選擇了GNAS作為關鍵靶點（圖2），該蛋白參與胰島素分泌和cAMP信號通路。
圖2. 活性成分靶蛋白鑒定
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基于Octet® 非標記分子互作分析系統垂釣GNAS相互作用的活性小分子
——以“單”釣“粗”
研究者建立了一種基于Octet® 的垂釣技術，其無流路設計允許多次垂釣，以富集低豐度且結合能力較弱的小分子，從而提升垂釣的成功率。研究人員將GNAS蛋白固化至Octet® SA傳感器表面，再與中藥提取物結合，雖然中藥提取物是粗樣品成分復雜，且含有高濃度的DMSO，但是BLI技術對溶劑不敏感從而避免了傳統流路方法導致的系統堵塞和有機溶劑高折光率導致的假陽性問題，確保獲得高靈敏度且準確的結果。隨后提取物被解離至緩沖液中，將解離液使用UHPLC-Q/TOF-MS/MS分析GNAS垂釣出的小分子。通過垂釣組與對照組的相對含量變化篩選26個小分子可能與GNAS有相互作用。
圖3. Octet® 垂釣結果：GNAS結合較強的化合物以及相對含量比值
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活性小分子的驗證
Octet® 驗證發現其中7個化合物顯示出強結合活性，均是是SJG的主要成分。其中，黃芪中的Formononetin、高麗參的三七皂苷Ft1和人參皂苷中的甲素人參F2為“君”、地黃中的Catapol為“臣”，五味子中的五味子素A和茜草中的沒食子酸為“佐使”，符合中醫配伍“君臣佐使”原則。
圖4. Octet® 驗證小分子和GNAS的結合
參芪降糖顆粒（SJG）用于糖尿病腎病的治療，因此人腎小球系膜細胞（HMCs）是理想的細胞模型用于進一步驗證上述的小分子藥物活性，通過HMCs驗證了垂釣出的活性成分對cAMP通路的影響，SJG及7種有效成分對高糖誘導的HMCs有保護作用。
圖5. 基于cAMP途徑驗證活性化合物對GNAS下游通路的影響
綜上所述，通過結合TCM-MPs富集策略和Octet® 垂釣技術，研究者能夠有效地篩選出與GNAS直接相互作用的活性化合物，并驗證了這些化合物通過激活cAMP通路的潛在藥理作用。該垂釣策略有望應用于篩選與各種復雜系統作用相關的靶蛋白和關鍵靶蛋白中的生物活性成分，為基于靶標的藥物發現提供有效的信息，對于中藥復雜體系的藥物靶點發現具有重要意義。
與傳統方法相比，使用Octet® 進行垂釣的優勢在于：
提供多種傳感器固化已知分子，并且盡可能減少非特異性吸附
通過垂釣的BLI信號，可以判斷是否有物質釣出
可以自動化多次循環，在同一個孔里富集洗脫樣品
由于Octet®采用非標記實時技術，可以對純化后的活性分子結合能力進行更可準確的驗證
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-參考文獻-
[1] Zhang H, et al. Discovery of drug targets based on traditional Chinese medicine microspheres (TCM-MPs) fishing strategy combined with bio-layer interferometry (BLI) technology. Anal Chim Acta. 2024 May 29;1305:342542.
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