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植物P型ATP酶（P type ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光度法定量檢測試劑是一種旨在使用P型ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，在釩酸鹽存在與否的情況下，受到P型 ATP酶的水解產(chǎn)生的ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)，即采用光度法測定其氧化后吸光峰值（NADH濃度）的變化，以此進行測算樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等P型ATP酶的特異性活性檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。

 

技術(shù)背景

 

腺苷三磷酸酶，又稱為ATP酶（adenosine triphosphatase；ATPase或ATP phosphohydrolase；EC3.6.1.3），屬于磷酸水解酶，可以催化含磷的酸酐分解，即催化三磷酸腺苷分解為二磷酸腺苷和無機磷。ATP酶的去磷酸化反應(yīng)釋放出能量，成為細胞生命代謝的能源。ATP酶為跨膜蛋白（transmembrane），幫助傳輸各種代謝分子進出細胞。根據(jù)ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能，分為五類不同的ATP酶，即F、V、A、P和E型。P型ATP酶，又稱為E1-E2 ATP酶，通常由一條或兩條多肽構(gòu)成，且呈現(xiàn)兩種主要的結(jié)構(gòu)構(gòu)象E1和E2。這類ATP酶存在于細菌和真核細胞膜和細胞器上，其功能在于水解ATP獲得能量，跨膜運輸各種化學(xué)分子，包括離子和磷脂，例如H⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺等。P型ATP酶可以分成4種，Ca²⁺傳輸性、Na⁺-K⁺ /H⁺-K⁺傳輸性、H⁺傳輸性和所有細菌型等。 基于ATP，在P型ATP酶抑制劑釩酸鹽（vanadate） 存在與否的情況下，受到P型ATP酶的水解，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來定量分析P型ATP酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

P type ATPase

 ATP  +  H2O  →    ADP  +  Pi

Vanadate

 

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate +  ATP

               

lactate dehydrogenase

pyruvate +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

    （高吸收峰）    （低吸收峰）

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）         60毫升

裂解液（Reagent B）             20毫升

緩沖液（Reagent C）         20毫升

酶促液（Reagent D）            500微升

反應(yīng)液A（Reagent E1）            1.2毫升

反應(yīng)液B（Reagent E2）            1.2毫升

底物液（Reagent F）          2.5毫升

陰性液（Reagent G）            1毫升

專性液（Reagent H）           1.2毫升

產(chǎn)品說明書                1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）和反應(yīng)液B（Reagent E2）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

微型臺式離心機：用于樣品制備

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。

 

一、 樣品準備（總蛋白制備）

 

1． 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定組織重量 

2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入適量的（1克組織需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的1毫升裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放進預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管

11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）

12． 即刻移入到1.5毫升離心管

13． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

14． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

二、測定準備

 

1． 準備好待測樣品，置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為28℃）：波長為340nm，間隔5分鐘，讀數(shù)7次（共30分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

三、 背景對照測定

 

1． 移取630微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反應(yīng)液A（Reagent E1）

4． 加入100微升反應(yīng)液B（Reagent E2）

5． 加入100微升底物液（Reagent F）

6． 放進28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

7． 加入50微升陰性液（Reagent G）

8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

 

四、樣品總活性測定

 

1． 移取630微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升酶促液（Reagent D）

3． 加入100微升反應(yīng)液A（Reagent E1）

4． 加入100微升反應(yīng)液B（Reagent E2）

5． 加入100微升底物液（Reagent F）

6． 放進28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

7． 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）

8． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

 

五、樣品非特異活性測定

 

1. 移取730微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2. 加入20微升酶促液（Reagent D）

3. 加入100微升專性液（Reagent H）

4. 加入100微升底物液（Reagent F）

5. 放進28℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6. 加入50微升待測樣品（注意：100微克總蛋白；樣品須溶解）

7. 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8. 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)30分鐘

 

六、 計算樣品活性

 

1）樣品活性（總活性和非特異活性）

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或30（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

或者

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品重量；毫克）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 10或 30（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫克 

 

單位＝微摩爾NADH/分鐘

 

2）樣品特異活性

 

樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性

 

注意事項

 

1． 本產(chǎn)品為21次操作（10個樣本），包括背景對照測定

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議使用質(zhì)膜樣品為佳（植物組織質(zhì)膜（plasma membrane）分離試劑盒—16022）

5． 建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、EDTA、EGTA等，可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等

6． 加入樣品啟動反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測定

7． 反應(yīng)測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)30分鐘

8． 測定值由高到低變化，即0分鐘測定讀數(shù)高于10分鐘或30分鐘測定讀數(shù)，表明有酶活性

9． 光度測定后，比色皿須清洗*

10． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）

11． 樣品特異活性是指釩酸鹽敏感的P型ATP酶

12． P型ATP酶活性單位濃度定義：在28℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列ATP酶類分析技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標準

 

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確