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在單克隆抗體開發和生產的許多階段，測定 IgG 的產生是關鍵步驟。常用的 IgG 定量測定方法要么需要特殊儀器和嫻熟人員，例如高效液相色譜法 (HPLC) 和表面干擾量度法，要么需要耗時的測定法，例如酶聯免疫吸附檢測 (ELISA)，盡管 ELISA 是一種被廣泛認可的蛋白定量方法，但它操作過程時間長，步驟多。而Valitacell公司 的 Valita®TITER通過熒光偏振（FP）檢測實驗，可在細胞系開發工作流程中精確快速定量IgG。

 高質量藥物開發篩選高通量IgG定量平臺

基于熒光偏振(FP)技術Valita®TITER 實驗可以用來檢測 IgG Fc 與蛋白G的相互作用。96 孔微量滴定板的每個孔都涂有熒光標記的 IgG 結合肽蛋白G。向孔中添加樣本時，蛋白G分子重懸并與之發生結合。蛋白G結合抗體時，其分子運動的速度下降，從而導致熒光偏振值升高。

Valita® TITER實驗原理

Valita® TITER實驗流程

如上圖所示，Valita®TITER整個實驗流程無需對樣本做任何處理，無需額外添加任何試劑，更沒有洗板等復雜操作步驟，僅需不到15分鐘就能完成96個樣的IgG定量，非常的簡單高效！

ValitaCell提供了一個全面優化的快速、穩健和準確的IgG檢測平臺，本文我們以Valita®TITER IgG定量試劑盒與Molecular Devices酶標儀結合使用為例。

實驗材料

•  Valitacell Valita®TITER Kit (cat. #VAL003) 或

•  Valitacell Valita®TITER Plus Kit (cat. #VAL004)

•  Sigma IgG standard (Sigma cat. #I2511)

•   XP Media™ CHO Growth A (Molecular Devices cat.

#K8860), supplemented with 4 mM L-glutamine

•  SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader或

•  SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader或

•  SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader或

•  SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Reader

實驗方法

1.  使用XP Media™ CHO Growth A作為稀釋液，對IgG標準品進行一系列稀釋，稀釋濃度從2.5-100mg/L (Valita®TITER Kit)或100-2000mg/L (Valita®TITER Plus Kit)。

2.  向微孔板中加入60μL培養基。

3.  加入60μL標準品或樣品到相應的孔中，吸打3次混勻（實驗過程可參考下圖）。

4.  微孔板常溫避光孵育5分鐘(Valita®TITER Kit)或15分鐘(Valita®TITER Plus Kit)，用Molecular Devices酶標儀讀取數據，酶標儀參數設置參考下表。

適用于 Valita®TITER Kit 酶標儀參數設置表

適用于 Valita®TITER Plus Kit 酶標儀參數設置表

實驗結果

研究人員開展的這項工作，主要是為了確定Valita®TITER在Molecular Devices多種型號酶標儀上使用時的最佳參數，以便為高通量藥物發現和開發提供一個高性價比高通量IgG測定平臺。只需通過簡單的加入-讀板方法制備IgG標準曲線，沒有樣品前處理、微孔板預處理、洗板等步驟，實驗流程簡單易操作。

如SpectraMax iD5酶標儀使用485 nm激發光和535 nm發射光可獲得優異的實驗結果。IgG標準品濃度從2.5mg/L到100mg/L(Valita®TITER)或從100mg/L到2000mg/L (Valita®TITER Plus)在整個范圍內具有很好的線性（R² = 0.99）（如下圖）。Valita®TITER Kit 和 Valita®TITER Plus Kit在SpectraMax i3x、Paradigm和 M5平臺的實驗數據見下表。SoftMax®Pro軟件中的預設置功能可自動進行mP計算和曲線繪制。

Valita®TITER Kit(R²=0.993)標準曲線

Valita®TITER Plus Kit(R²=0.998)標準曲線

 Valita®TITER Kit在Molecular Devices各平臺實驗數據

Valita®TITER Plus Kit在Molecular Devices各平臺實驗數據

結論

準確、可靠地測量IgG濃度以確保生物制劑生產時最佳細胞培養性能，對藥物開發和后續生產至關重要。一種能夠以最少的時間和資源投入獲得準確結果的分析方法是成功的關鍵。在這里，我們成功地證明了結合Molecular Devices酶標儀和Valita®TITER的測定方法能夠全面的準確定量IgG濃度。

Valita®TITER分析是一種均相的、高通量的方法，能精確和快速定量IgG濃度，不需要樣品制備或純化步驟。該96孔檢測方法已在SpectraMax iD5酶標儀和其他具有FP檢測的Molecular Devices酶標儀上充分驗證，以確保結果可靠。SoftMax Pro軟件能自動進行標準曲線擬合和樣本定量，減少檢測的設置時間。

高質量藥物開發篩選高通量IgG定量平臺

Valita®TITER適用儀器平臺

Valita®TITER兼容市面上常見的多種熒光偏振酶標儀，并且由于Valita®TITER的實驗流程非常簡單，該方法不光局限于人工手動操作，還能整合入各種半自動、全自動生產線中，從而實現真正的高通量檢測。

Valita®TITER兼容多種市面常見品牌的讀板儀

Valita®TITER能整合入各種自動化生產線

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