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特異鱟試劑制備的方法

時間:2022/9/27閱讀:971
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自從1981年日本學者Kakinuma A 等報道“一種抗癌物質( 1-3) -β-D-葡聚糖[(1-3)-β-D-Glucan可使試劑凝聚"以來,由于其涉及細菌內毒素檢查的特異性,引起各國學者的注意。

 

 

一、(1-3-β-D-葡聚糖的本質與來源

 

Kakinuma A等在作抗癌物質葡聚糖熱原試驗時,不含發熱物質的葡聚糖能引起試驗呈陽性反應Loretta APearsen FC也報道血液透析器上存在試驗反應物質LAL-Reactive Materia lLAL-RM,以后有報道凡經過銅銨人造絲透析膜的制品均存在使試驗陽性但不是內毒素的物質。1983年日本學者中村隆范報道了這一物質具有如下結構:

 

1-3-β-葡聚糖外,1-41-6-β-葡聚糖同樣使試驗產生陽性結果這些物質的總稱為真菌多糖Fungal polysaccharide,普遍存在于真菌細胞壁。如果這類物質具有像內毒素一樣的致熱活性細菌內毒素檢查和熱原檢查結果的符合率會接近一致。但是恰恰相反,真菌多糖似乎不是一種致熱物質,文獻報道1.00.010. 0001mg/mL的真菌多糖溶液劑量按10mL/kg,進行熱原試驗的結果3h3只家兔最高升溫的均值分別為0.23±0.030.13±0. 090.20±0.10。這將導致在使用普通試劑檢測某些樣品時出現細菌內毒素檢查不合格,熱原檢查合格的現象。造成對這些物質熱原檢查的錯判。1990Ikemura K等將試驗反應機理和各種干擾內毒素檢查物質及干擾部位歸納如下:

 

 

由此可知,鱟試劑檢測內毒素出現非特異性結果是不奇怪的。為了使細菌內毒素檢查與熱原檢查的結果趨向一致,使用特異試劑是*必要的。

 

二、特異試劑制備

 

1968Levin JBang F B創建試劑以來,使內毒素的檢測成為靈敏、快速、簡便的方法,已被舉世*并被美、日、中、歐洲藥典以《細菌內毒素試驗》收載,但是由于上述非特異性的存在,使這一試驗的實際應用受到一定限制。為了克服這一弊端各國學者進行了深入研究。由于上述試驗反應機理已被闡明,設法阻止右側旁路反應,便能使試劑對內毒素的檢測達到特異性的目的。

 

日本最先推出的特異試劑其商品名為En-dospecy其生產工藝的特點是將普通試劑中存在的G因子,以親和層析方法分離去除。國內有人稱無G因子試劑。顯然,試劑中沒有G因子,即使被測樣品中存在真菌多糖非內毒素,也不能產生活化的G因子在反應旁路系統中就不能激活凝固酶原旁路反應被阻斷,使成為對內毒素具有特異性。

 

國內吳偉洪等報道以同樣方法制備了僅含CB因子的試劑。但是以這種工藝制備的特異試劑由于在分離G因子的過程中,必需防止帶入微量內毒素,即所用分離試劑、柱床、器皿及操作過程,嚴防內毒素污染,不僅增加了制備工藝的難度,也必然增加試劑的成本,因此很難推廣應用。

 

1989Berzofsty R N報道在制備普通試劑時,為了提高檢測內毒素的靈敏度,均采用氯仿提取存在于試劑粗制品中的抗LPS脂多糖因子。氯仿提取的結果確實增加了試劑的靈敏度,但同時將存在于試劑粗制品中的抗G因子一同除去,這就使普通試劑易被真菌多糖激活增加了普通試劑的非特異性。因此提出不用氯仿提取改用一種特殊試劑,只除去抗LPS因子,而保留抗G因子,以達到即增加了對內毒素的敏感性,又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。這是從試劑的生產工藝上進行改革,實現提供商品特異試劑的一種方法。

 

1990Tsuchiya M報道,由于真菌多糖與普通試劑反應形成凝膠有一個特定濃度范圍10 -3~10-6mg/mL,大于或小于這個濃度都不能成膠故在制備普通試劑的基礎上,加入過量的真菌多糖( 1mg/mL),可阻止G因子的活化“封閉"了旁路達到制備特異試劑的目的。顯然采用這一措施制備特異試劑較以上兩種方法既簡便又經濟,可使特試劑商品化。

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