丁酰膽*酯酶抑制劑活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號: BC5980

規格: 50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1支試劑一，加入1.8mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝后可保存4周，避免反復凍融（該試劑為凍干試劑，可能存在不同瓶間肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現象，此現象不影響使用，實際質量相同）。

2. 試劑四：臨用前加入17mL試劑二，充分溶解，用不完的試劑-20℃可分裝保存4周，避免反復凍融。

3. 試劑五：10mmol/L利凡斯的明溶液。臨用前取15μL 10mmol/L利凡斯的明溶液，加入985μL蒸餾水，配制成0.15mmol/L利凡斯的明溶液，現用現配（此試劑用于陽性管實驗，選做）。

產品說明：

丁酰膽*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又稱血漿膽*酯酶，假性膽*酯酶，是一種絲*酸水解酶，由肝臟合成后進入血液，幾乎存在于所有動物組織中。與乙酰膽*酯酶（AchE）相比，BchE能夠有效水解較大的膽*酯，如丁酰膽*和苯甲酰膽*，而且可以清除有機磷類農藥、氨基甲酸酯類農藥等神經毒劑的毒害作用。有研究表明，BchE可作為阿爾茨海默病治療的重要靶點，BchE抑制劑被用于改善阿爾茨海默病患者記憶力減退、認知功能障礙等病征。

BchE催化丁酰膽*水解生成膽*，膽*與二硫代硝基 苯甲酸（DTNB）作用生成5-巰基-硝基 苯甲酸（TNB），BchE抑制劑通過抑制BchE活性，減少丁酰膽*的水解。TNB在412nm處有吸收峰，可通過測定412nm處吸光度的變化，計算BchE抑制劑活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、天平、烘箱、粉碎儀/研缽/勻漿器、30-50目篩、超聲清洗儀、離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、1mL玻璃比色皿、可調式移液槍、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體的操作步驟請見“產品資料”文件

注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性和穩定性，請嚴格控制反應時間和操作時間。

2. 樣本吸光度A’_測定大于1.5或ΔA_測定接近ΔA_空白時，建議在樣本處理步驟增加組織樣本比例或將粉劑樣本配制成更高濃度的溶液再進行測定。當ΔA_測定小于0.01時，可以將樣本用提取液稀釋后再進行測定。

3. 若用于比較不同試劑、提取物、藥物或組織對BchE的抑制程度，必須將試劑、提取物、藥物或組織勻漿配制成相同濃度進行比較。

實驗實例：

1. 取0.1005g柚果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進行超聲提取，離心后取上清，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.372-0.205）-（0.166-0.112）=1.113，ΔA_測定=（A’_測定-A_測定）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.117-0.485）-（0.166-0.112）=0.578，計算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（1.113-0.578）÷1.113×100%=48.068%。

2. 取0.1014g柿果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進行超聲提取，離心后取上清，稀釋16倍后按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.372-0.205）-（0.166-0.112）=1.113，ΔA_測定=（A’_測定-A_測定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.706-0.149）-（0.166-0.112）=0.503，計算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（1.113-0.503）÷1.113×100%=54.807%。

3. 取50μL 0.15mmol/L利凡斯的明溶液，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.372-0.205）-（0.166-0.112）=1.113，ΔA_測定=（A’_測定-A_測定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.838-0.171）-（0.166-0.112）=0.613，計算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（1.113-0.613）÷1.113×100%=44.924%。

參考文獻：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Noor Atatreh, Sara Al Rawashdah, Shaikha S Al Neyadi. et al. Discovery of new butyrylcholinesterase inhibitors via structure-based virtual screening [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1): 1373-1379.

[3] Li Q, Chen Y, Xing S. et al. Highly Potent and Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors for Cognitive Improvement and Neuroprotection [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(10): 6856-6876.

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